3種沙眼衣原體POCT檢測試劑盒性能評估*

趙 穎，王 瑤，徐英春，倪安平△

(1.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京 100730；2.侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730)

沙眼衣原體生殖道感染是最常見傳播疾病之一，大多數無癥狀感染，但若不及時治療，沙眼衣原體可引起女性輸卵管瘢痕化，并可導致女性異位妊娠和輸卵管因素不孕、盆腔炎、慢性盆腔疼痛,可引起男性尿道炎、附睪炎、直腸炎,并且衣原體感染會增加人類免疫缺陷病毒(HIV)的易感性[1-4]。即時檢測(POCT)試劑盒能夠通過免疫色譜法檢測生殖道的沙眼衣原體，可用于早期診斷，雖靈敏度(25%～65%)沒有核酸檢測方法高，但其可以快速得到結果，從而大大縮短檢測和治療之間的時間，并提高治愈率，不同生產廠家的試劑盒在靈敏度和特異度方面具有差異[5-8]。本研究對3種不同生產廠家的商品化沙眼衣原體POCT試劑盒進行方法學評價。

1 材料與方法

1.1標本來源

1.1.1BGMK細胞株 BGMK細胞株用于沙眼衣原體培養，購自英國南安普頓大學微生物系。細胞培養液為10%胎牛血清D-MEM(HyClone公司)，胎牛血清D-MEM購自Gibco公司。

1.1.2沙眼衣原體菌株 沙眼衣原體血清型D(D/IC-Cal-S/ON)和血清型E(E/DK-20/ON)，購自英國南安普頓大學微生物系。

1.1.3沙眼衣原體菌株培養 詳細方法見文獻[9-11]。BGMK細胞生長于75 cm2細胞培養瓶(NUNC公司)，待生長成為單層細胞后傾去細胞培養液，加入沙眼衣原體生長液，即10%胎牛血清D-MEM,含2 g/mL放線菌酮(Sigma公司)。然后分別接種沙眼衣原體血清型D和血清型E，接種完畢后離心細胞培養瓶，即1 600 r/min(700 g,Beckman J6-MC)35 ℃離心60 min。離心完畢后置于5% CO2和37 ℃培養72 h。倒置顯微鏡(Olympus IX71)下看見大量生長的沙眼衣原體包涵體。收獲沙眼衣原體，即細胞刷(Corning-Costar公司)刮下感染細胞，超聲波破碎感染細胞，1 600 r/min離心10 min去除細胞碎片，16 000 r/min高速離心10 min沉淀衣原體，再懸浮于0.2 mol/L 蔗糖磷酸鹽緩沖液(2SP)，并在液氮內保存。

1.1.4沙眼衣原體濃度確定 BGMK細胞生長于含直徑13 mm蓋玻片的24孔細胞培養板(Corning-Costar公司)內，吸去細胞培養液，加入沙眼衣原體生長液。接種上述系列稀釋的沙眼衣原體血清型D和E，然后離心24孔培養板，即2 400 r/min(1 500 g,Beckman J6-MC)35 ℃離心60 min。離心完畢后置于5% CO2和37 ℃培養48 h。吸去培養液，PBS洗滌2次，甲醇固定蓋玻片10 min?？股逞垡略w單克隆抗體(Micro Trak,美國Syva公司)直接熒光法染色蓋玻片，熒光顯微鏡(Olympus BX51)下計數包涵體數量，最終換算確定制備的沙眼衣原體血清型D和E濃度分別為1.86×1011IFU/mL和2.80×1011IFU/mL。IFU為包涵體形成單位。

1.2試劑 試劑盒A：衣原體抗原檢測試劑盒(膠體金法，韓國Standard Diagnostics，Inc.)。試劑盒B：沙眼衣原體抗原檢測試劑盒(乳膠免疫層析法，南京黎明生物制品有限公司)。試劑盒C：沙眼衣原體抗原檢測試劑盒(膠體金法，上海凱創生物技術有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1最低檢出限檢測 待測樣本沙眼衣原體濃度：沙眼衣原體血清型D和血清型E凍存毒株，經細胞培養法滴定的濃度分別為1.86×1011IFU/mL和2.80×1011IFU/mL，化凍后使用生理鹽水進行系列稀釋，見表1。

表1 生理鹽水進行系列稀釋結果

比對方法：(1)2 970 μL生理鹽水+30 μL毒株，即為10-2稀釋，最終濃度為1.86×109IFU/mL。再取1.86×109IFU/mL沙眼衣原體300 μL+2 700 μL生理鹽水，即為10-1稀釋，稀釋后濃度為1.86×108IFU/mL。以此類推至10-5稀釋，最終濃度為1.86×106IFU/mL。先從10-2稀釋開始，做好標識，每個濃度分別用加樣槍加50 μL至各試劑盒配套拭子上。(2)分別將加樣后的拭子，置于對應試劑盒的裂解液內，再滴入檢測窗內，按照規定的時間讀取結果。以此類推，每個濃度分別檢測，直到3種試劑盒均為陰性檢測結果。(3)在陰性結果的上一個稀釋度(陽性檢測結果)，使用生理鹽水進行倍比稀釋，如1.86×108IFU/mL，倍比稀釋為9.30×107IFU/mL、4.70×107IFU/mL、2.30×107IFU/mL……同上方法，再次對每個濃度分別檢測，最終確定每種試劑盒檢測靈敏度的濃度絕對值。

1.3.2重復性比對試驗 使用最終檢測陽性結果的上一個滴度進行重復性試驗，共計5次，由于沙眼衣原體毒株是活的微生物，且免疫層析方法POCT試劑盒制造及檢測步驟簡單，故僅進行批內重復性檢測。

1.3.3特異度試驗 待測樣本：(1)人胚肺成纖維細胞MRC-5，濃度為2.9×106/mL，超聲波裂解物。(2)非洲綠猴腎細胞系BGMK，系沙眼衣原體的培養細胞，濃度為5.0×106/mL，超聲波裂解物。(3)標準菌株ATCC25922大腸埃希菌，采用新鮮純培養菌株，用生理鹽水調制成0.5麥氏單位濃度(1.5×108CFU/mL)菌懸液。試驗方法:上述3個樣本，不稀釋，分別用加樣槍加50 μL至各試劑盒配套拭子上，分別進行檢測。

2 結 果

2.1最低檢出限試驗結果 對于沙眼衣原體血清型D的檢測，試劑盒B和試劑盒C均能達到1.86×107IFU/mL，結果觀察試劑盒B較試劑盒C陽性略明顯一些(條帶顏色更深)，試劑盒B在1.86×106IFU/mL也隱約可見條帶，但試劑盒C在1.86×106IFU/mL無陽性跡象；試劑盒A僅能檢測到1.86×109IFU/mL，并且條帶顏色較另外兩種試劑盒弱。見表2。對于沙眼衣原體血清型E檢測，試劑盒B和試劑盒C均能達到2.80×107IFU/mL，但陽性均為弱陽性；試劑盒A僅能檢測到2.80×109IFU/mL，并且條帶顏色較另外2種試劑盒弱。

表2 最低檢出限試驗結果

注：w+表示弱陽性，+表示陽性，-表示陰性

2.2重復性比對試驗結果 對于沙眼衣原體血清型D檢測，試劑盒B和試劑盒C均能達到1.86×107IFU/mL，再進行2倍稀釋后檢測，2家結果均顯示較弱陽性，因此，選擇1.86×107IFU/mL進行重復性試驗。試劑盒A僅能檢測到1.86×109IFU/mL，并且條帶顏色較另外2種試劑盒弱，再進行2倍稀釋后檢測，結果顯示較弱陽性，因此，選擇1.86×109IFU/mL進行重復性試驗。見表3。

對于沙眼衣原體血清型E檢測，試劑盒B和試劑盒C均能達到2.80×107IFU/mL，但為弱陽性，因此，從2.80×108IFU/mL進行2倍稀釋為1.40×108IFU/mL和7.00×107IFU/mL后分別檢測，2家結果1.40×108IFU/mL得到陽性結果，7.00×107IFU/mL僅得到弱陽性結果，因此，選擇1.40×108IFU/mL進行重復性試驗；試劑盒A僅能檢測到2.80×109IFU/mL，并且條帶顏色較另外2種試劑盒弱，再進行2倍稀釋后檢測，結果顯示較弱陽性，因此，選擇2.80×109IFU/mL進行重復性試驗。3種試劑盒結果重復時均陽性，但是均存在陽性條帶顯示顏色強弱不完全一致的情況。

表3 重復性比對試驗結果

2.3特異度試驗結果 3種試劑盒在檢測3種特異度干擾標本時均為陰性結果。見表4。

表4 特異度比對試驗結果

3 討 論

沙眼衣原體感染引起的性傳播疾病在許多國家已躍居性傳播疾病首位，在美國成為最常見性傳播疾病，2015年上報病例數超過1 500 000例。歐洲篩查的無癥狀婦女沙眼衣原體感染的患病率為1.7%～17.0%[3-4]。我國性病流行以前以梅毒和淋病為主，近幾年來，非淋球菌性尿道炎/宮頸炎的病例數已超過了淋病和梅毒，位居第1位。我國報道沙眼衣原體感染率為2.2%～10.0%，女性患病率更高[12]。目前核酸擴增法(CT NAATs)因其靈敏度和特異度均很好，常作為診斷沙眼衣原體感染的方法[13]。但許多實驗室不具備開展分子生物學檢測條件，需要進行快速初篩時，采用最多的是膠體金免疫層析法。有文獻報道POCT的成本效益比核酸擴增法更優，對公眾健康的益處更大[7-8]。目前，國家食品藥品監督管理總局(CFDA)批準的沙眼衣原體抗原檢測試劑盒共有11個品種，質量參差不齊，POCT沙眼衣原體檢測試劑盒存在靈敏度低的問題，從中找到質量好(靈敏度及特異度均高)且價格合理的試劑盒非常重要。

目前,國內從事沙眼衣原體篩查的實驗室很少具備培養沙眼衣原體的條件，對試劑盒的評估手段有限，選擇試劑盒較為盲目。本文評價方法簡單有效，本實驗結果可作為實驗室選擇試劑盒的參考依據。

沙眼衣原體體可分為很多血清型，其中沙眼衣原體A、B、Ba、C血清型可引起沙眼，D～K血清型可引起泌尿生殖道感染[14-16]。國內沙眼衣原體血清型D和E 是泌尿生殖道感染中較常見的血清型，國內上市的免疫層析法(包括POCT)快速檢測沙眼衣原體試劑盒，臨床主要用于男女生殖道沙眼衣原體感染的檢測。本實驗室保存了來自英國南安普頓大學微生物系的沙眼衣原體血清型D(D/IC-Cal-S/ON)和血清型E(E/DK-20/ON)，因此，選擇血清型D和E進行本次實驗。

通常靈敏度和特異度是使用和評價試劑盒的重要參數。人胚肺成纖維細胞MRC-5細胞系來自14周齡男性胎兒的正常肺組織，系人源細胞系。當采集生殖道標本用于沙眼衣原體快速檢測時，標本中會含有數量不等的人源上皮細胞，因此，有必要驗證試劑盒是否對高濃度人源細胞裂解物存在交叉反應。非洲綠猴腎細胞系從非洲綠猴的腎臟上皮細胞中分離培養出來，常用于沙眼衣原體的培養，采用非洲綠猴腎細胞系作為干擾物是驗證用于培養的組織細胞成分是否對試劑盒檢測有干擾。大腸埃希菌為引起泌尿生殖道感染最常見病原菌，約75%的尿路感染由大腸埃希菌引起，選擇大腸埃希菌作為干擾物來驗證試劑盒是否受到其他泌尿生殖道常見病原體的干擾。在特異度方面，本次試驗結果顯示，3種試劑盒均能夠抗人胚肺成纖維細胞MRC-5(2.9×106/mL)，非洲綠猴腎細胞系BGMK(濃度為5.0×106/mL)和標準菌株ATCC25922大腸埃希菌(1.5×108CFU/mL)的干擾。在重復性方面，3種試劑盒也無差異。靈敏度方面，筆者確定了3種不同廠家的商品POCT試劑盒在檢測沙眼衣原體時的真實檢出限，即絕對濃度，以IFU/mL表示，反應試劑盒的真實靈敏度，為本實驗室及其他醫療機構實驗室選擇檢測試劑盒提供參考。本次實驗結果中，3種試劑盒均未達到非常理想的水平。對于沙眼衣原體血清型D的檢測，試劑盒B和試劑盒C均能達到1.86×107IFU/mL，結果觀察試劑盒B較試劑盒C陽性略明顯(條帶顏色更深)，試劑盒B在1.86×106IFU/mL隱約可見條帶，但試劑盒C在1.86×106IFU/mL無陽性跡象；試劑盒A僅檢測到1.86×109IFU/mL，且條帶顏色較另外2種試劑盒弱。對于沙眼衣原體血清型E檢測，試劑盒B和試劑盒C均能達到2.8×107IFU/mL，但均為弱陽性；試劑盒A僅能檢測到2.8×109IFU/mL，且條帶顏色較另外2種試劑盒弱。綜上所述，本研究顯示檢測檢出限方面，試劑盒B和試劑盒C明顯優于試劑盒A，試劑盒B略優于試劑盒C。

一般醫療機構實驗室評估沙眼衣原體PCCT試劑盒的手段有限，選擇試劑盒較為盲目，本研究采用保存的沙眼衣原體株確定了3種不同廠家的商品POCT試劑盒在檢測沙眼衣原體時的真實檢出限，即絕對濃度，反應了試劑盒的真實靈敏度，并且采用可能相關干擾物進行特異度評價，方法科學簡單有效，為其他醫療機構實驗室選擇檢測試劑盒提供具體可靠的參考依據。