膿毒癥大鼠基質金屬蛋白酶表達與血腦屏障通透性改變的關系

楊 光,魯衛華,曹迎亞,祁羽鵬

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 重癥醫學科,安徽 蕪湖 241001)

膿毒癥相關性腦病(sepsis associated encephalopathy，SAE)是由膿毒癥或全身炎癥反應綜合征所導致的彌漫性腦功能障礙，一般缺乏中樞神經系統感染的臨床或實驗室證據，同時需要排除肝性腦病、腎性腦病和肺性腦病等代謝性腦??；通常以譫妄、認知及行為功能障礙等為表現，SAE是 ICU常見的神經功能障礙性疾病。SAE發病機制至今尚未完全闡明，目前認為血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)損傷、氨基酸的改變和神經遞質的改變、線粒體功能障礙和神經細胞凋亡等可能與SAE發病有關[1]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種鋅依賴的蛋白水解酶，MMPs受多層次調控，以酶原形式存在，激活過程中受絲氨酸蛋白酶或纖維蛋白酶的介導，也可自主催化激活。生理狀態下MMPs參與組織發育、轉錄水平調控、傷口愈合、酶原的激活及血管生成等；病理情況下MMPs 作為腦組織重要的蛋白水解酶，可降解緊密連接蛋白和血管基底膜，導致血腦屏障結構破壞，增加血腦屏障通透性。在腦創傷、腦缺血和腦出血動物模型上發現MMPs表達升高和緊密連接蛋白降低，但關于膿毒癥大鼠MMPs的研究報道甚少[2-3]。本研究通過盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)制作膿毒癥大鼠模型，探討MMP-9在膿毒癥大鼠皮質區域血腦屏障通透性改變的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 TNF-α ELISA試劑盒(批號：02/2018)購于上海酶聯生物公司，MMP-9、Occludin和β-actin 抗體(批號：10375-2,13409-1,10904-1)均購于武漢三鷹生物技術公司。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康雄性SD大鼠72只，體質量200～260 g(南京市青龍山動物繁殖場)。按隨機數字表隨機分為4組：對照組(C)、CLP 24 h 模型組(CLP24 h)、CLP 48 h模型組(CLP48 h)、CLP 72 h模型組(CLP72 h)，每組18只。每組隨機取6只用于檢測血腦屏障通透性，6只用于ELISA和Western blot檢測，6只用于免疫組化檢測。

1.3 模型制備 本研究通過CLP制作膿毒癥大鼠模型，各組大鼠術前禁食12 h，用10%水合氯醛，按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。腹中線做長約1.5 cm切口，暴露盲腸后，在盲腸末端1/3處結扎，使用22號針頭貫穿末端盲腸兩次，并輕輕擠壓少許腸內容物，后逐層縫合關閉腹腔，術后大鼠予以皮下注射30 mL/kg生理鹽水并自由進水進食，空白對照組不進行任何處理。

1.4 炎癥因子測定 C組大鼠腹主動脈取血后處死大鼠，CLP 24 h組、48 h組和72 h組分別在CLP術后24 h、48 h和72 h腹主動脈取血后處死大鼠，分離血清后據ELISA檢測試劑盒說明書，測定血清TNF-α含量。

1.5 免疫組化檢測 各組大鼠腹主動脈取血后迅速斷頭取腦，切除小腦，4%多聚甲醛固定液4℃固定2 d，石蠟包埋，蠟塊做連續切片，貼片于防脫載玻片上，烤片5 h后，將組織切片脫蠟，用中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察MMP-9在皮質區域的表達。

1.6 Western blot 檢測 各組大鼠腹主動脈取血后迅速斷頭取腦，切除小腦，冰上分離皮質海馬。無菌小剪刀將皮質剪碎，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min后,4℃ 12 000 r/min 離心 30 min，取上清，采用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度的測定。然后進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗孵育4℃過夜，洗膜，室溫下與相應二抗孵育1 h，加入ECL顯影劑曝光。使用Image J軟件對曝光條帶進行灰度值分析。

1.7 BBB通透性的測定 伊文思藍(Evans blue，EB)滲透法分析 BBB 通透性變化[4]，大鼠處死1.5 h前，2% EB按3 mL/kg股靜脈注射，1.5 h后打開胸腔,心內灌注生理鹽水至右心耳流出無色液體時停止，立即斷頭取腦,每100 mg腦皮質加入1 mL甲酰胺溶液,60℃避光水浴24 h,離心后取上清在酶標儀上(620 nm)進行比色,同時制作標準曲線。

1.8 統計學處理 采用 SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TNF-α含量及血腦屏障通透性變化的比較 膿毒癥可導致炎癥因子增高和血腦屏障通透性增加，與C組比較，TNF-α、血腦屏障通透性在造模后24 h升高(P<0.05)，72 h達到最高。見表1。

組別TNF-α/(ng/L)EB/(μg/g)C151.18±12.630.41±0.10CLP24 h173.56±7.71a0.63±0.08aCLP48 h204.88±22.08ab1.77±0.39abCLP72 h221.79±10.87ab2.33±0.65abF29.01534.137P0.0000.000

注：與C組比較，aP<0.05;與CLP24 h組比較，bP<0.05。

2.2 各組大鼠腦皮質MMP-9表達變化 免疫組化染色結果顯示，膿毒癥可引起MMP-9陽性染色增強，但在造模后24、48 h無明顯增強，造模后72 h增強明顯。如圖1所示。

圖1 各組大鼠腦皮質MMP-9表達(×100)

2.3 各組大鼠腦皮質Occludin表達變化 結果顯示(如圖2)，與C組比較，Occludin在造模后24 h、48 h表達降低不明顯，但在72 h表達下降(P<0.05)。如表2所示。

圖2 Western blot檢測Occludin表達

組別 Occludin/β-actinC1.33±0.09CLP24 h 1.17±0.03CLP48 h 1.13±0.11CLP72 h0.93 ±0.04aF14.308P0.001

注：與C組比較，aP<0.05。

3 討論

SAE發病機制尚未明確，BBB受損可能是SAE發病的重要機制之一[5]，BBB是由腦內的血管內皮細胞通過各種連接蛋白彼此緊密相連，并與周細胞和星形膠質細胞相互作用形成的特殊屏障系統，BBB 嚴格限制血液中的神經毒性物質、炎癥因子、免疫細胞等進入中樞神經系統，進而維持大腦微環境的穩態，保證神經系統功能的正常發揮[3]。

Michels等[4]研究發現膿毒癥大鼠海馬區域BBB通透性增加，并且膿毒癥大鼠出現認知功能改變。由于血腦屏障的通透性增加，各類炎癥因子、細胞因子和假性神經遞質可較易進入腦實質，進而影響腦組織的循環灌注，物質代謝，信號傳遞等過程，從而加重SAE[6-7]。

膿毒癥不同時期BBB破壞的機制尚未明確，本研究通過膿毒癥大鼠模型發現膿毒癥大鼠腦皮質區MMP-9表達增加，與空白對照組比較，MMP-9在造模后24 h、48 h表達增加不明顯，但在72 h表達明顯增高。同時在造模后72 h緊密連接蛋白Occludin表達降低最為明顯，BBB通透性最高，從而提示MMP-9可能與膿毒癥晚期皮質區域BBB通透性改變有關。

Higashida T等[8]發現腦創傷大鼠模型建立24 h后即出現MMP-9表達增加，緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達降低，血腦屏障破壞及腦組織水腫，使用米諾環素治療腦創傷大鼠后，MMP-9表達降低，同時緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達增高，血腦屏障破壞及腦組織水腫減輕，從而提示MMP-9可能與早期腦創傷大鼠血腦屏障的破壞有關。本研究中膿毒癥大鼠造模24 h、48 h后MMP-9表達增加不明顯，但在72 h表達明顯增高，同時BBB破壞最嚴重?？赡苁怯捎赟AE繼發于膿毒癥或全身炎癥反應綜合征，待炎癥反應達到一定程度后引起MMP-9表達明顯增高。

本研究中隨著造模時間的延長，血清中TNF-α含量逐漸增高，與空白對照組比較，在造模后24 h差異即具有統計學意義；同時隨著造模時間的延長，膿毒癥大鼠少動、動作遲緩及團縮等表現逐漸明顯。TNF-α被認為是膿毒癥時最重要的炎癥介質，TNF-α可誘導中性粒細胞浸潤腦組織、中性粒細胞凋亡和腦水腫的發生，同時也影響中樞神經系統介質多巴胺、去甲腎上腺素及血清素的神經傳遞功能，引起認知功能減退[9]。此外，Tsuge M等[10]發現增加血清中TNF-α含量能夠激活腦組織中MMP-9，進而增加BBB通透性。

綜上所述，膿毒癥時MMP-9表達增多，緊密連接蛋白減少，可能是SAE的發病機制之一，不同時期BBB通透性破壞的機制目前尚不十分清楚，有待進一步的研究。