帕金森病模型大鼠的痛覺敏化及其時反應量-效關系

李光建，張雙雙，李 巖，梁 坤，林浩然，汪萌芽

(皖南醫學院 1.細胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的中老年中樞神經系統退行性疾病[1-3]，臨床表現除運動遲緩、靜止性震顫、姿勢平衡障礙、肌強直等運動癥狀外[3-4]，還有認知功能障礙、精神障礙、睡眠障礙、自主神經功能障礙、疼痛等非運動癥狀[4-5]。在眾多的非運動癥狀中，疼痛[6]作為一種高發生率，低就診率的癥狀，臨床表現形式多樣，按患病率由高到低依次為肌肉骨骼性疼痛、肌張力障礙性疼痛等[6-7]。其發病機制考慮與PD相關病變侵犯痛覺傳導通道有關，PD 相關性疼痛一直未受到足夠的重視,目前尚無規范的治療方案，以臨床經驗用藥為主。PD患者存在正中神經感覺受損及痛覺耐受閾值下降[8-9]。PD 疼痛的發生是否與疼痛閾值降低有關，目前還在爭論中[10]。時反應量-效關系(timed dose-response relationship，TDRR) 概念的提出及其相關數學模型的設計，原旨在用于藥物的藥理或毒理作用分析[11-13]。在對時反應量-效關系的概念、特點、數學模型方面進行探討后，我們實驗室先后進行過大鼠空間學習記憶能力測試的時反應量-效關系[14-15]和大鼠痛覺時反應量-效關系[16]的探究。在此基礎上，本研究旨在觀察PD模型大鼠的痛覺特征，并探討和分析帕金森病模型大鼠的痛覺敏化與痛覺時反應量-效關系，以期為帕金森病的痛覺發生與疼痛閾值的關系等方面提供新的研究思路和實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級別(250±10)g成年雄性SD大鼠55只，由南京青龍山動物繁殖場提供，許可證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 儀器和藥品 腦立體定位儀(瑞沃德，68000系列)、光輻射熱測痛儀(ZH-YLS-12A，安徽正華生物儀器設備有限公司)、Von Frey纖維絲刺激針(Von Frey hairs測痛儀，North Coast Medical,Inc.,CA,USA)、微量注射泵(ALC-LP660，上海奧爾科特生物科技有限公司)、6-hydroxydopamine(美國 Sigma 公司，批號：MKCB5847)、鹽酸阿撲嗎啡(美國 Sigma 公司，批號：SLBP2431V)、20% 烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20161208)、青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號：國藥準字H20144727)、3% 過氧化氫(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160120)、其他常規哺乳動物手術器械等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 取55只雄性SD大鼠隨機分為正常組(n=13)、假手術組(n=8)和模型組(n=34)。

1.3.2 PD大鼠模型制備 采用單側紋狀體兩點法雙靶點注射神經毒素6-羥多巴胺(6-OHDA) 制備PD大鼠模型[17]。34只SD大鼠用 20%烏拉坦麻醉( 1.5 g/kg，ip)，直至夾捏刺激無明顯反應。麻醉穩定后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，參照 Paxinos G 等大鼠腦立體定位圖譜[18]，確定右側紋狀體兩點坐標，第1點(尾殼核內):前囟前0.72 mm，中線右側2.6 mm，硬膜下5.0和6.0 mm；第2點(蒼白球內):前囟后0.36 mm，中線右側3.6 mm，硬膜下5.0和6.0 mm。以前囟為坐標原點，確定好顱骨表面尾殼核注藥點坐標，用顱骨鉆鉆一直徑為2 mm小孔，將一次性吸入5 μL 終濃度為 2.5 g/L 的 6-OHDA 溶液的微量注射器連接于立體定位儀上，垂直入顱，緩慢進針，在硬膜下6 mm處注入 2.5 μL 6-OHDA溶液，注藥速度為 1 μL/ min，留針 5 min 后緩慢退針至硬膜下5 mm 處，注入剩余的(2.5 μL)6-OHDA 溶液，留針5 min 后以1 mm/min 的速度緩慢退針。蒼白球注藥點的注藥方式同上。注射完成后進行縫合，在縫合處墊上明膠海綿并在術后連續3 d給予20萬U青霉素(腹腔注射)，預防感染。模型組大鼠在術后意外死亡2只，納入模型鑒定的大鼠數為32只。假手術組用生理鹽水代替 6-OHDA 溶液，其余步驟與實驗組相同，因在術后意外死亡2只，納入統計的假手術組大鼠數為6只。

1.3.3 帕金森病大鼠模型鑒定 所有受試大鼠分別于造模第2、4 周后腹腔注射阿樸嗎啡(0.25 mg/kg) 檢測行為學變化[17]。注射后 3～5 min 觀察大鼠的行為學表現，如出現肢體僵直，并以健側(左側)后肢為支點，向健側旋轉，且旋轉圈數≥210 圈/30 min 的大鼠鑒定為成功模型。

1.3.4 痛覺檢測

1.3.4.1 機械痛閾值檢測 帕金森病模型檢驗成功后，將3組大鼠放置在纖維絲透明紗網的測量裝置上進行連續3 d，每天30 min的適應性訓練，適應結束后用Von Frey纖維絲刺激針(Von Frey hairs測痛儀)[19]在質量分別為2、4、6、8、10、15和20 g進行大鼠的機械刺激縮足反應閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)檢測。

1.3.4.2 光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測 機械痛閾值檢測完成后，用光輻射熱測痛儀，對3組大鼠進行不同光照強度下甩尾反應潛伏期(tail-flick latency，TFL)的移位法測定[16]，即首次在距鼠尾根部1 cm處,隨后每隔0.5 cm依次后移光照位點，進行5個光照強度的檢測，設定光輻射熱測痛儀的光照強度(Focus值)為15、23、34、51、76，隨后依次測定各組大鼠在不同光強下的TFL，即為甩尾反應的TDRR數據。室溫控制在(25±1)℃。

2 結果

2.1 造模后第2周和第4周的模型鑒定 采用χ2檢驗的方法，對第2周和第4周帕金森病模型的鑒定結果進行統計分析，在納入模型檢測的模型組大鼠32只中，第2周成功模型為20只，第4周成功模型為27只，造模成功率顯示第4周的成功率高于第2周，最終造模成功率為84%(χ2=3.925,P=0.048)。

2.2 PWMT 對3組大鼠進行了機械痛檢測，結果如圖1顯示，模型組(n=27)較另兩組大鼠的PWMT降低(P<0.01)，且假手術組(n=6)與正常組(n=13)大鼠相似(P>0.05)。

正常組(Normal)：n=13，模型組(Model)：n=27，假手術組(Sham operation)：n=6，單因素方差分析：P<0.01，Newman-Keuls兩兩對比檢驗：*P<0.01。

圖1 3組大鼠的機械刺激縮足反應閾值(PWMT)比較

2.3 光輻射熱TFL 按照傳統痛覺的分析方法，將3組大鼠TFL分別在34、51、76光強度(單位為Focus值)進行單因素方差分析，結果3組差異均具有統計學意義(P<0.01，表1)，且在光照強度在34、51、76時模型組大鼠的TFL較另兩組均縮短(P<0.01)，而另兩組間均相似(P>0.05)。

分組n光照強度(Focus值)345176正常組1313.50±1.223.38±0.632.20±0.65模型組279.52± 2.14*#2.28±0.36*#1.36±0.20*#假手術組614.41±0.59 3.01±0.161.88±0.04F32.01622.03526.618P0.0000.0000.000

q檢驗，與正常組比：*P<0.01，與假手術組比：#P<0.01。

2.4 光輻射熱痛覺TDRR 對光輻射熱TFL的TDRR數據(圖2)，用重復測量的雙因素方差分析，顯示因素光強度(F=9.537,P<0.01)、光強度×組間(F=54.891,P<0.01)及組間(F=39.839,P<0.01)的變異均有統計學意義。不僅提示帕金森病模型大鼠光輻射熱TFL存在TDRR關系，還表明其在不同組間不同，其組間兩兩比較顯示模型組TFL的TDRR較另兩組明顯左移(P<0.01)，而假手術組與正常組相似(P>0.05) 。

進一步對3組大鼠的光強度-TFL關系數據分別用雙曲線型TDRR模型[15-16]Y=cs+1/(x-a)s+b進行曲線擬合，其中模型組大鼠的TDRR曲線較正常組和假手術組左移，正常組和假手術組相似，各組主要擬合參數結果見表2，其中模型組參數主要顯示參數a較另兩組減小的變化。

圖2 3組大鼠的光輻射熱痛覺TDRR

采用雙曲線型TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b進行非線性擬合，單獨標出的點為3組大鼠在Focus值23時的TFL值，均為最大值15 s。，正常組(Normal)：n=13，模型組(Model)：n=27，假手術組(Sham operation)：n=6。雙因素方差分析(重復測量)：因素光強度F=9.537,P<0.01；光強度×組間F=54.891,P<0.01；組間F=39.839,P<0.01。在此之后兩兩對比檢驗：#P<0.01(模型組與另外兩組對比)。

表2 3組大鼠光輻射熱痛覺TDRR的雙曲線模型擬合參數

組別cs abR2正常組26.074.8743.152.0330.9730模型組41.297.303-17.471.2610.8971假手術組7.541.35729.001.2540.9955

3 討論

PD為繼阿爾茨海默病后第2個常見的神經退行性疾病，這種疾病的特點是黑質致密部的多巴胺能神經元損毀50%～70%，即紋狀體DA嚴重缺失[20]。近年來PD動物模型的研究較多，造模的方法多種多樣，目前神經毒性分子在神經生物學中被廣泛用于損毀黑質紋狀體DA系統，作為PD模型復制最常用的一種工具[21]。本研究采用了單側紋狀體兩點法雙靶點注射神經毒素6-羥多巴胺(6-OHDA)的方法制備PD大鼠模型[19]，與其他腦區相比，注射紋狀體區的造模成功率更高[22]，本次實驗觀察到的結果也得到了驗證，并為進一步的痛覺及其TDRR分析奠定了基礎。

本次實驗在造模成功之后，進行了機械痛閾值檢測和光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測兩種痛覺的檢測方法，結果顯示機械痛閾值檢測中與正常組和假手術組相比，模型組的機械痛閾值較小，顯示帕金森病模型大鼠的機械痛覺出現了敏化；對光輻射熱痛甩尾潛伏期數據進行常規的單因素方差分析，將3組分別在34、51、76強度進行單因素方差分析，結果顯示光照強度在34、51、76時模型組大鼠的TFL均較另兩組縮短，顯示在各個強度上PD模型大鼠的痛覺都出現了敏化，這與機械痛檢測的結果一致。進一步對光輻射熱痛實驗檢測數據的TDRR進行重復測量的雙因素方差分析，結果表明了隨著光照強度的增加各組大鼠甩尾潛伏期逐漸縮短，在光強度和組間因素間存在交互影響，而且TDRR關系在3組之間存在差異。經過雙曲線型TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b的非線性擬合，結果呈現出隨光照強度增加甩尾反應潛伏期逐漸縮短的負相關 TDRR關系曲線[11-13](光照強度增加時潛伏期不是無限縮短)，這與藥物劑量與其藥物作用潛伏期的關系相類似，理論上該TDRR屬于T型雙曲線關系，但是該潛伏期有上限性數據，即有一個固定的最長潛伏期 15 s，應歸于T型雙曲線關系的特殊形式 P型雙曲線關系[11-12]，假手術和正常組同模型組一樣有TDRR的存在，在對3組進行雙曲線型TDRR模型Y=cs+1/(x-a)s+b非線性擬合得到的作圖結果更清楚地顯示模型組左移的特點。由此可見，機械痛閾值檢測和光輻射熱痛甩尾潛伏期檢測結果都顯示PD模型大鼠的痛覺敏化，而光輻射熱痛覺TDRR的分析則進一步表明，PD模型大鼠同樣存在痛覺TDRR，但出現痛覺TDRR曲線的左移，更全面地顯示了PD模型大鼠的痛覺敏化特征。

臨床研究表明，PD患者存在正中神經感覺受損的癥狀，因此就會導致疼痛耐受閾值下降[8]，但PD疼痛的發生與疼痛閾值降低的相關性還缺乏充分的依據。本實驗運用了類似于藥理學的TDRR,通過恒定空間效應觀察光照強度與時間效應的關系[12]。本實驗是通過這種時反應量-效關系觀察和分析了PD模型大鼠、正常組大鼠的TDRR特點，結果顯示PD模型大鼠的TDRR曲線較正常組大鼠左移的情況，這證明了PD模型大鼠存在痛覺敏化的特點，表明了PD 疼痛的發生可能與閾值降低有關，給目前爭論的PD 疼痛的發生是否與疼痛閾值降低有關[10]提供了參考，也為臨床治療和預防PD的疼痛癥狀提供了實驗基礎，對PD非運動性癥狀的相關研究也提供了新思路。至于PD模型大鼠痛覺敏化的機制還需要進一步的研究來闡明。