FOXO4和nNOS在星型膠質細胞瘤中的表達及意義

齊 敏，劉溪林，趙 健，吳 鋒，孫樂安，鄭蘭榮

(皖南醫學院 1.人體解剖學實驗實訓中心；2.研究生學院；3.人體解剖學教研室；4.病理解剖學教研室,安徽 蕪湖 241002)

星型膠質細胞瘤在膠質瘤(Glioma)中占絕大多數，具有高侵襲性、高致死率特點[1]。傳統治療方法(手術、化療和放療)并沒有完全解決膠質瘤侵襲性生長所致的高復發率的難題[2]。越來越多的研究者從基因水平研究腫瘤侵襲性、血管生成及腫瘤發生率。轉錄因子叉頭框蛋白O4(Forkhead boxO4，FOXO4)具有廣泛的生物學功能，包括調節細胞的能量代謝、增殖、凋亡和分化[3]。神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)具有神經毒性作用[4]。本研究應用免疫組化和免疫熒光檢測FOXO4和nNOS在星型膠質細胞瘤中的表達情況，并分析其與臨床病理特征之間的關系，旨在闡明FOXO4和nNOS在星型膠質細胞瘤發生發展中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 從弋磯山醫院病理科調取2013年1月～2018年1月行外科手術切除的星型膠質細胞瘤石蠟標本27例，其中男性14例，女性13例；年齡30～75歲。所有星型膠質細胞瘤患者術前均未接受任何抗腫瘤治療。術后病理按WHO分級標準，其中Ⅰ級5例、Ⅱ級8例、Ⅲ級10例、Ⅳ級4例。另取材時采用瘤周組織作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗FOXO4和nNOS、抗熒光淬滅劑和SABC試劑盒均購于北京博奧森生物技術有限公司。熒光二抗購于英國Abcam公司，DAPI購于南京凱基生物有限公司。

1.3 免疫組化檢測 取各例星型膠質細胞瘤的石蠟標本進行切片，片厚5 μm。按照免疫組化試劑盒說明書依次進行各步驟，封片，鏡下觀察。高倍鏡下每個腫瘤切片隨機選取2個視野，圖像分析軟件測量400倍視野下FOXO4與nNOS在不同級別星形膠質細胞瘤中陽性產物的平均灰度值(灰度值越大說明表達越弱，反之則越強)。對照組用PBS替代一抗做為陰性對照。

1.4 免疫熒光檢測 取各例星型膠質細胞瘤的石蠟標本進行切片，片厚5 μm。按照免疫熒光的方法依次孵育一抗、熒光二抗、DAPI染核等。最后用抗熒光淬滅劑封片，透明指甲油封邊，在熒光顯微鏡下觀察。高倍鏡下每個腫瘤切片隨機選取1個視野，觀察熒光強弱，比較FOXO4與nNOS在高級別(Ⅲ、Ⅳ級)與低級別(Ⅰ級、Ⅱ級)星型膠質細胞瘤中的表達情況。對照組用PBS替代一抗做陰性對照。

2 結果

2.1 FOXO4的免疫組化和免疫熒光表達 免疫組織化學染色檢測結果顯示，低級別和高級別星型膠質細胞瘤均可見FOXO4陽性細胞，呈棕黃色或棕褐色，著色主要位于胞核。腫瘤組織FOXO4的陽性表達比瘤周正常腦組織低(圖1)。

結果顯示，Ⅳ級、Ⅲ級和Ⅱ級星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞的平均灰度值高于Ⅰ級星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞(P<0.05)，Ⅳ級和Ⅲ級星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞的平均灰度值高于Ⅱ級星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞(P<0.05)，Ⅳ級星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞的平均灰度值高于Ⅲ級星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞(P<0.05)，見圖2、表1。

左上角為瘤周組織，著色較深，右下角為腫瘤組織，著色較淺。黑色箭頭所示為瘤周組織中FOXO4陽性細胞，紅色箭頭所示為Ⅲ級星形膠質細胞瘤中FOXO4陽性細胞。該視野下隨機選取四個腫瘤細胞和四個瘤周細胞，測得灰度值平均值分別為88.72，129.75(SABC法，×200)。

圖1 星型膠質細胞瘤及瘤周組織中FOXO4表達

箭頭所示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級星形膠質細胞瘤瘤組織中FOXO4 陽性細胞。標尺=30 μm(SABC法，×400)。

圖2 各級別星型膠質細胞瘤瘤組織FOXO4的表達

表1 星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞的平均灰度值

組別n灰度值FPⅠ級565.78±5.25aⅡ級8105.50±5.61b778.4400.000Ⅲ級10153.20±1.90cⅣ級4172.40±1.45d

注：多組間兩兩比較。符號不同表示P<0.05。

免疫熒光方法檢測，完成DAPI細胞核染色(呈藍色熒光)，FOXO4染色(呈綠色熒光)，兩者疊加(Merge)后可以證實FOXO4染色基本位于細胞核。同時熒光染色條件下，可觀察到低級別的星型膠質細胞瘤陽性表達率高于高級別(圖3)。

2.2 nNOS的表達 免疫組織化學染色檢測結果顯示，低級別和高級別星型膠質細胞瘤瘤組織均可見nNOS陽性細胞，呈棕黃色或棕褐色，胞質和胞膜著色。腫瘤組織FOXO4的陽性表達比瘤周正常腦組織高(圖4)。

圖中用DAPI標記的為星型膠質瘤細胞的核定位，可發現FOXO4的表達隨著腫瘤惡性程度的增加而降低(免疫熒光，×400)。

圖3 各級星型膠質細胞瘤瘤組織FOXO4陽性表達

左上角為腫瘤組織，著色較深，右下角為瘤周組織，著色較淺。黑色箭頭所示為瘤周組織中nNOS陽性細胞，紅色箭頭所示為Ⅲ級星形膠質細胞瘤組織中nNOS陽性細胞。該視野下隨機選取四個腫瘤細胞和四個瘤周細胞，測得灰度值平均值分別為94.07、158.76(SABC法，×200)。

圖4 星型膠質細胞瘤及瘤周組織中nNOS表達

結果顯示，Ⅳ級、Ⅲ級和Ⅱ級星型膠質細胞瘤組織nNOS陽性細胞的平均灰度值低于Ⅰ級星型膠質細胞瘤組織nNOS陽性細胞(P<0.05)，Ⅳ級和Ⅲ級星型膠質細胞瘤組織nNOS陽性細胞的平均灰度值低于Ⅱ級星型膠質細胞瘤組織nNOS陽性細胞(P<0.05)，Ⅳ級星型膠質細胞瘤組織nNOS陽性細胞的平均灰度值低于Ⅲ級星型膠質細胞瘤組織nNOS陽性細胞(P<0.05)，見圖5、表2。

免疫熒光結果顯示，nNOS在高級別星型膠質細胞瘤瘤組織中的陽性表達高于低級別的星型膠質細胞瘤(圖6)。

表2 星型膠質細胞瘤組織FOXO4陽性細胞的平均灰度值

組別n灰度值FPⅠ級5163.30±2.79eⅡ級8156.10±1.94f464.6890.000Ⅲ級10114.10±2.45gⅣ級486.39±8.87h

注：多組間兩兩比較。符號不同表示P<0.05。

箭頭所示為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級星型膠質細胞瘤瘤組織中nNOS陽性細胞。標尺=30 μm(SABC法，×400)。

圖5 各級別星型膠質細胞瘤瘤組織中nNOS的陽性表達

圖中用DAPI標記的為星型膠質瘤細胞的核定位，可發現nNOS的表達隨著腫瘤惡性程度的增加而增強(免疫熒光，×400)。

圖6 各級星型膠質細胞瘤nNOS陽性表達

3 討論

人腦星型膠質細胞瘤是中樞神經系統中常見的惡性腫瘤，與神經系統以外的其他腫瘤不同，該腫瘤不發生轉移但具有很強的侵襲性[5]。膠質瘤細胞的高度侵襲性和高度血管生成能力是影響預后的重要原因。FOXO4轉錄因子為FOXO家族成員，FOXO家族參與各種信號通路，調節細胞周期進程，DNA損傷修復和分化，并促進細胞死亡[6]。FOXO家族受多種信號通路調控，其中最明顯的受PI3K-Akt/PKB介導磷酸化級聯通路的負調控[7-8]。在鼻咽癌組織中，FOXO4受mir-421的直接靶向作用，引起FOXO4表達的下調，表現為腫瘤細胞的增殖增強[9]。大量研究顯示，FOXO4在肺癌、結腸癌、膀胱癌等多種人類腫瘤中的表達都有所下調或缺失,FOXO4在腫瘤中的表達較正常組織的表達減少[6-12]。本研究結果顯示，隨著星形膠質細胞瘤級別的增加，FOXO4的表達逐漸減少，呈負相關，這與FOXO4在其他腫瘤中的表達基本一致。據此，結合既往研究與本研究結果進一步提示，FOXO4可能具有抑制腫瘤細胞增殖、血管生成的作用，其下調或缺失可致腫瘤的生長加速。由此可見，FOXO4可能是一個潛在的非特異性(廣譜)的癌癥治療靶點。

NO是腦組織中重要的信使分子，參與了腫瘤的病理生理過程[13]。大腦額葉一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)陽性神經元的生長發育對其他多種神經元和神經膠質細胞的分化、增殖、遷移以及大腦血管的生長發育具有重要作用。NOS及其催化L-精氨酸形成的NO，在機體內具有廣泛的生物學作用,可參與神經元發育、軸突生長、突觸形成和修復過程，在腫瘤形成等過程中發揮重要作用[14-15]。有研究發現NOS及其催化而形成的NO，在口腔鱗癌、胃癌、大腸癌等多種腫瘤中有重要作用[16-18]。NO使得膠質瘤細胞運動增加，NOS抑制劑可能在神經腫瘤學中有治療作用[18-19]。nNOS為NOS同功酶的三種亞型之一，nNOS被認為有神經毒性作用[4-5]。正常的腦組織nNOS表達較少，腦組織的高脂濃度和高能量要求，使其特別容易受到自由基和氧化劑介導的損傷：腦深部神經元NADPH-d/nNOS標記的神經元減少[19]。本次實驗結果顯示，nNOS在高級別(Ⅲ、Ⅳ級)星形膠質細胞瘤中表達高于低級別(Ⅰ、Ⅱ級)星形膠質細胞瘤，提示腫瘤相關因子nNOS的異常高表達可能與人腦星型膠質細胞瘤的惡性程度以及侵襲性生長有關。具體機制有待進一步研究，以期為治療星形膠質細胞瘤靶向藥物的研究提供參考資料。

鑒于轉錄因子FOXO4和腫瘤相關因子nNOS參與了腫瘤的生長、轉移過程[3-4]，本研究結果表明FOXO4、nNOS的異常表達可能與星形膠質細胞瘤的浸潤性生長有關，下一步將深入研究驗證FOXO4、nNOS與星形膠質細胞瘤病理級別的關系，并尋找FOXO4、nNOS兩種因子對于腫瘤的具體作用機制和通路，從基因水平進一步探討星形膠質細胞瘤的發生發展機制。