HPV-18型晚期基因L1在宮頸脫落細胞中的表達與突變研究

汪 萍,宛傳丹,趙一琳,崔燕紅,宮 磊,林愛琴,卜文婕,朱曉蕾

(1.皖南醫學院 醫學生物學教研室,安徽 蕪湖 241002；2.常熟市醫學檢驗所 分子生物學實驗室,江蘇 常熟 215500)

全球子宮頸癌每年新發病例85%以上集中在發展中國家,我國約占12%[1]。宮頸癌及其癌前病變均與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持續感染直接相關,尤以HPV 16和18型感染最為嚴重[2]。HPV病毒顆粒的殼蛋白L1由其晚期基因(late gene)編碼,是HPV病毒的主要結構蛋白[3]。在病毒整合入宿主染色體后,L1蛋白表達將缺失。因此,L1蛋白的表達情況能直觀地反映宮頸組織中HPV病毒感染狀態[4-6]。臨床檢測HPV-18 L1基因表達水平將有助于診斷HPV-18持續感染所造成的宮頸病變程度,目前對HPV-18型感染的宮頸疾病中L1基因表達情況研究較少[7-8]。本文檢測分析HPV-18型感染的宮頸脫落細胞中L1基因的蛋白表達陽性率分布,并針對L1基因突變進行測序分析,研究其在宮頸病變診斷中的作用與臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月～2017年8月在常熟市第一人民醫院、常熟市第二人民醫院、常熟市中醫院婦產科門診就診的宮頸疾病患者?；颊吣挲g21～65歲。以無菌棉拭子擦去宮頸口分泌物,再用錐形刷在宮頸口輕輕旋轉3周獲取脫落細胞標本。錐形刷置于專用細胞保存液試管中,盡快送檢。經HPV分型檢測,只收取單純HPV-18型感染的脫落細胞。依據患者臨床病理診斷分為慢性宮頸炎192例、宮頸上皮內瘤變CIN Ⅰ、CIN Ⅱ共143例、宮頸上皮內瘤變CIN Ⅲ 127例和宮頸癌41例。DNA提取與HPV分型檢測采用港龍生物HPV 26型(基因芯片法)試劑盒進行。

1.2 L1基因PCR 以上述所提取并經分型檢測為單純HPV-18型的DNA為模板,用特異性引物進行L1基因擴增PCR反應,引物核苷酸序列及PCR反應參數參考文獻[9-10]。PCR產物結果以1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.3 基因測序與比對 純化PCR擴增產物后進行Sanger法核苷酸序列測定(ABI 基因測序儀3500Dx)。將基因測序核苷酸結果與基因數據庫中HPV-18 L1基因序列(GenBank reference X05015)差異進行比較分析,再利用DNAStar軟件中的SeqMan程序分析基因區氨基酸序列變異。

1.4 L1殼蛋白檢測 采用自動制片系統進行制片,所制涂片在96%乙醇中固定20 min后進行染色。使用HPV L1細胞蛋白檢測試劑盒(購自美國Advanced公司)進行L1蛋白檢測分析。L1殼蛋白為核蛋白,細胞核呈紅色染色即為陽性染色,只要1個被紅染即可診斷L1蛋白陽性表達。

1.5 統計學分析 運用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。分類資料采用例數或百分數表示,組間比較采用χ2檢驗,趨勢分析采用χ2趨勢檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

注：M為DNA標準分子；L1為1690 bp

圖1 HPV-18型L1基因擴增片段電泳檢測圖

表1 不同分組中L1基因擴增陽性率比較[n(%)]

分級nL1基因陽性χ2P慢性宮頸炎192137(71.4)aCIN Ⅰ+Ⅱ14387(60.8)a94.4720.000CIN Ⅲ12733(26.0)b宮頸癌413(7.3)b

注：多組間兩兩比較,符號不同表示P<0.05。

2.2 基因突變分析 選取宮頸癌組20例進行L1基因序列測定。以突變類型分類,則20例中存在11種類型。對比GenBank中HPV-18 L1基因序列(GenBank reference X05015),通過SeqMan軟件分析發現其中4種錯義突變,導致氨基酸序列變異。包括第263位點C>G；第413位點C>T；第987位點A>C；第1256位點A>G。其余均為同義突變,并不導致L1殼蛋白氨基酸序列變化。結果見表2。

3 討論

高危型HR-HPV病毒基因能編碼出具有轉化功能的癌蛋白[11],能促進宮頸上皮細胞病變。由HPV-16和HPV-18持續感染造成的宮頸癌約占70%[12]。由于HPV病毒在持續感染過程中,其基因具有整合到宿主(人)染色體基因組中的能力,整合后HPV病毒晚期基因L1基因轉錄表達將逐漸缺失,當L1免疫靶蛋白表達缺失后,HPV病毒感染細胞將不能被免疫系統有效識別,進而促進了上皮細胞惡性病變[13]。

表2 20例宮頸癌患者HPV-18型L1基因測序突變情況

L1基因突變類型1234567891011121314151617181920c.263C>G*√√√√√√√c.413C>T*√√√c.438C>T√√√√√√√c.495A>T√√√√√√√√√c.495A>G√√√√√√√√c.969T>C√√√√c.987A>C*√√√√√c.1071T>C√√√√√√c.1236T>C√√√√√√c.1256A>G*√√√c.1287A>G√√√√√√√√

*表示引起氨基酸序列突變。

表3 病理分級分組中HPV-18型L1蛋白陽性率比較

分級nL1蛋白陽性[n(%)]χ2P慢性宮頸炎192192(100.0)aCIN Ⅰ+Ⅱ143117(81.8)b227.1690.000CIN Ⅲ12744(34.6)c宮頸癌415(12.2)d

注：多組間兩兩比較,符號不同表示P<0.05。

本研究中,L1蛋白在慢性宮頸炎中陽性率最高,隨著病變程度增加,其陽性率呈下降趨勢,至宮頸癌變后,脫落細胞標本中已檢測不出L1蛋白表達。宮頸病變病理分級越嚴重,其HPV病毒L1蛋白表達則越少。這與文獻[14-15]報道的HPV病毒早期基因(early gene,E基因)表達情況完全相反,E基因mRNA表達陽性率隨宮頸病變嚴重程度而上升。結果提示,HPV-18型晚期基因L1基因擴增陽性率與臨床宮頸疾病進展存在密切關系。L1表達的蛋白量與宮頸病變嚴重程度總體呈負相關趨勢。

L1基因表達的蛋白能觸發宿主免疫系統反應,因此,L1蛋白可作為人體細胞免疫反應靶蛋白,是HPV疫苗制作的抗原基礎。經基因測序分析發現20例宮頸癌變中HPV-18型的晚期基因L1基因序列存在11種突變,同一突變類型出現在多位病例中,并且同一病例也會出現多種突變類型的現象,其中4種突變導致蛋白一級結構氨基酸序列的轉換,而其余多數為無義突變,并不引起氨基酸的序列變化。突變位點類型中有9種已有報道[3,9-10],另有2種基因突變(c.969T>C,c.438C>T)本研究首次報道。

L1蛋白表達狀態直接反映病毒存在狀態以及病變程度,可作為HPV病毒感染的檢驗指標?；贚1基因表達的HPV檢測方法對宮頸疾病的早期篩查以及臨床診斷預后發揮著重要的臨床意義。研究基因突變形式對疫苗的研制與病毒感染的免疫治療等有著重要意義。L1基因序列的突變與致癌機制間的關系,目前尚不明確。這些突變對人體免疫系統的識別以及疫苗的預防與治療作用可能產生潛在的影響,這將是未來宮頸癌早期診斷與治療的研究方向。