CD3-CD19+B淋巴細胞及BAFF在自身免疫性溶血性貧血發病中的變化

何合勝，靳小可，劉善浩，徐又海，楊玉瓊，齊 晶

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 血液內科，安徽 蕪湖 241001)

自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)是由于產生抗自身紅細胞抗體導致紅細胞破壞發生溶血性貧血的一種器官特異性自身免疫性疾病。AIHA確切的發病機制非常復雜，對該病的研究目前更多集中在體液免疫及細胞免疫方面[1]。B淋巴細胞由于其分泌抗體的功能長期被認為在AIHA的發病機制中發揮重要作用，在臨床應用中針對CD20的單克隆抗體清除B淋巴細胞作為AIHA的二線治療手段，其對部分患者有效也進一步支持B淋巴細胞數量或者功能異?？赡軐е翧IHA疾病發生。B淋巴細胞活化因子(B-cell activating factor of the TNF family，BAFF)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，一般在巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞表達，對B淋巴細胞的增殖、分化及生存發揮重要作用[2]。鑒于B淋巴細胞在AIHA發病中的作用及BAFF與B淋巴細胞的相關性，我們通過流式細胞檢測CD3-CD19+B淋巴細胞的變化及ELISA方法檢測BAFF水平，探討上述兩個指標在AIHA發病中的變化及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年8月～2018年6月在弋磯山醫院及皖南醫學院第二附屬醫院門診及住院AIHA初發患者22例，其中男9例，女13例，年齡23～71歲，中位年齡52歲。納入健康志愿者14例，男6例，女8例，年齡25～57歲，中位年齡45歲。EDTA管抽取外周靜脈血進行流式細胞檢測，所有外周血血清采集分離后凍存于-80℃冰箱留作ELISA檢測時使用。

1.2 主要試劑及儀器 流式細胞儀檢測標記的抗體均購自eBioscience公司，BAFF的ELISA法檢測試劑盒購自R&D公司。流式細胞儀為BD公司產品。

1.3 實驗方法 分別抽取AIHA患者和健康志愿者外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝處理后，取100 mL新鮮EDTA管抗凝的血標本加入樣品測定管內，以CD3-CD19+淋巴細胞作為B淋巴細胞標記，通過流式細胞儀檢測CD3-CD19+B細胞占淋巴細胞總數的百分比。血清BAFF水平檢測采用定量ELISA法。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。數值以均數±標準差表示，組間差異采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血淋巴細胞分析 結果顯示，AIHA患者外周血中淋巴細胞絕對值與健康志愿者組差異無統計學意義(t=0.952，P=0.348)。見表1。

表1 兩組外周血淋巴細胞分析

組別n淋巴細胞絕對值 /(109/L) 健康志愿者141.31±0.30AIHA患者221.18±0.45

2.2 兩組外周血CD3-CD19+B細胞的表達 結果顯示，AIHA患者CD3-CD19+B細胞比例較健康志愿者升高，差異有統計學意義(t=2.793，P=0.009)。見表2。

2.3 兩組外周血BAFF濃度的檢測 結果顯示，AIHA患者細胞培養上清液中BAFF濃度較健康志愿者升高，差異有統計學意義(t=5.449，P=0.000)。見表3。

3 討論

AIHA 作為一種自身免疫性溶血疾病，目前針對該病的發病機制研究更多集中在體液免疫及細胞免疫方面[1]。近年來國內外學者分別從T、B淋巴細胞兩方面對AIHA疾病進行系列研究，試圖通過調節患者的免疫功能狀態來更精準地治療AIHA[3]。我們前期的研究發現AIHA患者Th17細胞增高、Breg細胞比例降低[4-5]，我們的研究豐富了對AIHA發病機制的更多認識。但是針對AIHA的發病機制研究，仍有許多懸而未決的問題，值得我們繼續進行后續相關的研究。

表2 兩組外周血CD3-CD19+B細胞的表達

組 別nCD3-CD19+B細胞/% 健康志愿者1411.38±3.17AIHA患者2215.79±5.32

表3 兩組外周血BAFF濃度

組別nBAFF濃度/ (ng/L) 健康志愿者14397.2±95.3AIHA患者22627.9±138.6

目前認為，B淋巴細胞功能或數量異常產生的抗紅細胞自身抗體是AIHA發病的主要因素之一。近年來，B淋巴細胞在AIHA發病機制中的作用日益受到重視。B淋巴細胞介導的體液免疫反應是一個非常復雜的過程，其活化、增殖、分化等受到多種體內外因素影響。有研究顯示同為自身免疫性疾病的ITP患者B淋巴細胞增高，推測可能與B淋巴細胞凋亡減少和過度增殖有關[6]。在我們的研究中，AIHA患者CD3-CD19+B細胞較健康志愿者增高，也支持B淋巴細胞參與AIHA的發病過程。但我們前期的研究表明AIHA患者呈現負向免疫調節功能的調節性B細胞水平下降[5]，因此B淋巴細胞在AIHA發病中具體的免疫調節作用應結合B細胞的不同亞群決定。

BAFF是腫瘤壞死因子超家族成員之一，為一種促進B細胞成熟和分化的刺激因子，能夠促進B淋巴細胞的增殖及分化。有研究[7]顯示,BAFF表達減少可導致B細胞數目下降并進一步影響體液免疫功能,BAFF過表達可激活自身反應性B細胞，通過使B淋巴細胞分化為漿細胞，從而不斷分泌自身抗體，在自身免疫性疾病的發生和進展中發揮一定的作用。已有研究證實[8-10]在系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、ITP等自身免疫性疾病患者血清中存在高水平的BAFF。本研究證實AIHA患者血清BAFF水平高于對照組，進一步支持BAFF在AIHA的發病中起到一定的作用。我們推測BAFF高表達激活自身反應性B細胞，不斷產生針對自身紅細胞的抗體，促進紅細胞破壞從而發生自身免疫性溶血。由于我們的條件有限，無法針對所有患者的紅細胞自身抗體常見類型IgG、C3檢測，因此無法評價BAFF濃度與紅細胞自身抗體類型是否存在一定關聯。臨床工作中通過檢測AIHA患者不同階段的BAFF水平，有助于評估療效，指導治療，同時也可以針對BAFF靶點開發出有針對性的靶向藥物。

目前治療AIHA的首選藥物為糖皮質激素，但由于該藥不能從根本上徹底阻斷根治AIHA，部分患者停用激素后存在復發或需要長期激素維持治療。相當多的患者因為糖皮質激素的不良反應，不能堅持長期服藥。另外有少部分患者經過激素、切脾治療后仍不能控制病情，迫切需要開發出更多治療AIHA的藥物。Belimumab(貝利木單抗)是第一個全人源化抗BAFF單克隆抗體，它通過特異性阻斷可溶性BAFF與BAFF受體的結合，從而抑制B細胞的生長，包括自體反應性B 細胞。同時減少B細胞分化為成熟漿細胞從而減少免疫球蛋白的產生[11]。目前已用于系統性紅斑狼瘡等自身免疫系統疾病的治療[8]。因此貝利木單抗對于AIHA，尤其難治復發性AIHA患者是一個可供選擇的治療藥物。

總之，我們的研究提示AIHA患者外周血BAFF濃度增高，可能促進B淋巴細胞活化，在AIHA發病中起著重要的作用，該研究結果有助于在臨床工作中通過檢測AIHA患者中的CD3-CD19+B細胞及BAFF濃度變化，能夠更全面地評估患者療效、病情演變，同時為通過針對BAFF的靶向藥物干預BAFF水平從而靶向治療該疾病提供新的方向。