長非編碼RNA GABPB1-AS1調控氧化應激適應性 線粒體生成的機制研究

徐 思，李 野

（四川師范大學 體育學院，四川 成都610100）

0 引言

運動誘導的線粒體生成是運動性適應的主要標志（Little et al.,2011），也是運動訓練促使運動能力增強的生理基礎（鄭莉芳 等,2018）。運動應激適應性線粒體生成依賴組織細胞對運動誘導的細胞氧化應激狀態的感知，并啟動下游調控線粒體生成因子的激活（Margaritelis et al.,2018），但其分子機制目前尚無定論。

長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是真核細胞中發現的一類長度大于200 nt的RNA分子，一般不編碼蛋白質，多數具有mRNA樣結構（經過剪切，具有PolyA尾巴，與啟動子有結合能力），是基因表達調控網絡的不可或缺的組成部分（Hung et al.,2010），調控作用范圍涉及轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳水平（Salmena et al.,2011），以信號分子、誘餌分子、引導分子、骨架分子等方式在細胞增殖、分化、應激適應、自噬以及死亡過程中呈現多重調控機制（Mercer et al., 2009）。氧化應激是調控應激適應發生的基本信號通路（Araki et al.,2016; Bisht et al.,2017; Kandola et al.,2015; Schieber et al.,2014），LncRNA在多個層次參與應激適應相關的氧化應激信號通路調控（Chen et al.,2014; Fuschi et al., 2019; Tehrani et al.,2018），是調節應激適應性組織結構與功能重塑的主要調控分子（史華俊 等,2012; Mercer et al.,2013; Valadkhan et al., 2016），而LncRNA在運動應激誘導的氧化應激應答與涉及線粒體生成的正性適應調控通路和機制上的相關分子及其作用仍然有待闡明。

GABPB1-AS1是核呼吸因子2β1亞基（GABPB1）（Hayashi et al.,2013）的反義RNA，全長4 139 nt，僅見于人類基因組。GABPB1-AS1是定位于細胞質的短壽LncRNA，一般狀態下半衰期很短，因而在細胞質中含量很低（Tani et al.,2013）。在多種因素導致的細胞氧化應激狀態下，GABPB1-AS1在細胞質中積累，積累程度與氧化應激刺激強度成正比（Tani et al.,2014），并且與細胞生存率呈正相關（Alkhateeb et al.,2019）。目前尚不清楚GABPB1-AS1這一表達特征的生理意義以及分子機制。

本研究檢測人源細胞氧化應激模型中GABPB1-AS1在應激因素消除后的表達特征及其對線粒體生成調控通路關鍵因子的調控作用，探討其在應激適應性線粒體生成過程中的調控信號通路和作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

雙氧水購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM（dulbecco minimum essential medium）培養基和0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000（Thermo Scientific）；ribo FECTTM CP轉染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（Thermo Scientific）；實時定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）試劑（美國Kapa Biosystems公司）；miR-101 mimic和inhibitor以及對應的negative control（廣州銳博生物科技有限公司）；RiboLock RNase Inhibitor（100 U/ml）、RNase A+T、RNA提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、體外轉錄試劑（Thermo Scientific）；ACTIN抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔/小鼠二抗、GABPB1、PCG-1α抗體（ProteinTech）；膠回收試劑盒（美國Promega公司）；本研究使用的引物及寡聚核酸均由上海吉瑪生物科技有限公司設計并合成（表1）。

表1 本研究使用的引物和寡聚核酸序列 Table 1 Primers and Oligonucleic Acid Sequences

1.3 細胞培養及干預方案

HUVEC細胞采用DMEM培養基（含10% FBS、100 U/ ml penicillin、100 μg/ml streptomycin），于CO2培養箱（37℃，5% CO2）中培養。使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養或其他實驗。

采用終濃度200 μM的H2O2處理HUVEC細胞3 h，構建細胞氧化應激模型。作用3 h后洗脫H2O2，更換培養基繼續培養，分別于2 h、4 h、8 h、16 h、24 h收集細胞用于核酸及蛋白質檢測等試驗。以正常培養HUVEC細胞作為對照，記為0 h。

1.4 細胞轉染

GABPB1-AS1的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和對照組NC序列見表1。GABPB1-AS1過表達質粒的構建方法：使用GABPB1-AS1序列引物對（表1）從HUVEC細胞cDNA中擴增片段，使用NheI 與BamHI酶切質粒后將片段插入pcDNA3.1載體中。

取生長狀態良好的HUVEC細胞均勻鋪于6孔板，將細胞密度控制在30%左右，12 h后進行轉染操作，miR-101 mimic和inhibitor以及對應的negative control使用ribo FECTTM CP轉染試劑按照說明書步驟進行轉染操作，GABPB1-AS1 siRNA和過表達質粒使用Lipofectamine 2000進行轉染。

1.5 RNA抽提和qPCR-RCR檢測

轉染48～72 h后，收集各組細胞。按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，用分光光度計檢測OD260/D280得到RNA濃度，再按逆轉錄試劑盒說明書操作得到cDNA。qRT-PCR檢測按照說明書操作，反應體系20 μl，反應程序：94℃ 3 min，94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個循環。數據分析采用相對定量法（2-ΔΔCT）。GAPDH基因作為定量實驗的內參，引物序列見表1。

1.6 蛋白提取和western bloting實驗

收集轉染的各組細胞，用預冷的PBS清洗細胞2次，加入蛋白酶抑制劑（PIC，Roche）的細胞裂解液在冰上裂解20 min，渦旋5次，每次10 s。4℃、13 000 rpm/min 離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。將得到的蛋白溶液和上樣緩沖液按5:1混合，煮沸10 min，得到細胞總蛋白樣品。采用10% SDS-PAGE分離膠電泳分離細胞總蛋白，濕轉法將蛋白從SDS-PAGE膠轉移至硝酸纖維素膜，電轉結束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將硝酸纖維素膜分別置于抗體稀釋液中，4℃孵育過夜。使用PBST（PBS+0.2% Tween20）漂洗5次，每次5 min，再將洗脫后的膜置于HRP標記的二抗稀釋液（稀釋比例1:10 000），室溫孵育1 h，再漂洗5次，每次5 min，顯影。以ACTIN作為內參蛋白。

1.7 GABPB1-AS1/miR-101-RNA pull down實驗

GABPB1-AS1（包含miR-101結合位點區域）序列克隆至載體pcDNA3.1，PCR引物序列見表1，將構建好的載體用BamH I酶切后，使用Roche體外轉錄試劑盒進行體外轉錄和生物素標記。轉錄結束后，加入DNase I消化轉錄模板，使用TRIzol抽提體外轉錄產物，定量后取3 ug RNA與HUVEC細胞提取液混合進行RNA pull down實驗。反應體系為25 mM Tris-Cl [pH 7.4]，150 mM NaCl，0.5% NP-40，0.5 mM DTT and 1×complete protease inhibitors（Roche），室溫孵育2～4 h后加入鏈霉素偶聯的T1 beads（Roche），孵育30 min后，洗脫5次，抽提RNA，逆轉錄后qRT-PCR檢測吸附的miR-101。

1.8 GABPB1-AS1/GABPB1 RNA pull down實驗

分別將GABPB1第1外顯子正義方向序列（1～447 nt）和反義方向序列（1～447 nt）按1.7方法體外轉錄和生物素標記，轉錄結束后，加入DNase I消化轉錄模板，使用TRIzol抽提體外轉錄產物，定量后各取3 ug RNA分別與HUVEC細胞提取液混合進行RNA pull down實驗。用于檢測GABPB1-AS1對GABPB1的親和作用的HUVEC細胞提取液（反應體系同前）加入100 U/ml的RNase-inhibitor，室溫孵育1 h后加入鏈霉素偶聯的T1 beads（Roche），孵育30 min后，洗脫5次，抽提RNA，逆轉錄后qRT-PCR檢測吸附的GABPB1序列。

1.9 RNase保護試驗（RNase protection assay，RPA）

如前所述的HUVEC細胞分離的RNA置于37℃ 1 h，然后用RNase A+T 37℃處理30 min。RNase A+T能降解單鏈RNA，但不能降解雙鏈RNA。RNase A+T處理后，用TRIzol提取RNA，生成cDNA，進行qRT-PCR檢測。

1.10 數據處理

數據用SPSS17.0軟件處理，以均數±標準差表示。采用獨立樣本t檢驗確定兩組間均值差異的顯著性，顯著性水平差異為P＜0.05。

2 實驗結果

2.1 GABPB1-AS1在氧化應激誘導下高表達，上調PGC-1α蛋白水平

HUVEC細胞經200 μM的H2O2作用3 h后細胞邊界略見皺縮，數量減少約10%，其他未見顯著異常（圖1A）。

qRT-PCR檢測H2O2作用后繼續培養2 h、4 h、8 h和16 h的HUVEC細胞的GABPB1-AS1的表達水平，結果顯示，H2O2處理的GABPB1-AS1在2 h和4 h表達水平增高至3.468倍和3.640倍，均顯著高于正常培養的HUVEC細胞（P＜0.01），8 h和16 h表達水平略下降，分別為2.77倍和2.20倍，顯著高于正常培養的HUVEC細胞中GABPB1-AS1（P＜0.01，P＜0.05）。采用western bloting檢測對應時段PGC-1α蛋白表達，結果顯示，與正常培養的HUVEC細胞中PGC-1α蛋白水平相比，2～16 h PGC-1α蛋白水平均顯著提高（圖1B）。

采用siRNA敲低HUVEC細胞的GABPB1-AS1，western bloting檢測其對PGC-1α蛋白水平的影響。結果表明，敲低GABPB1-AS1后PGC-1α蛋白水平下降（圖1C）。

構建GABPB1-AS1過表達質粒轉染HUVEC細胞，western bloting檢測其對PGC-1α蛋白水平的影響。結果表明，過表達GABPB1-AS1后PGC-1α蛋白水平升高（圖1D）。

圖1 H2O2氧化應激誘導高表達的GABPB1-AS1調控PGC-1α蛋白水平上調 Figure 1.The Overexpression of GABPB1-AS1 which was Induced by H2O2 Oxidative Stress Up-regulates the Protein Level of PGC-1α

2.2 1-AS1通過競爭性吸附miR-101，降低其對PGC-1α-mRNA翻譯的抑制作用

生物信息分析顯示，miR-101種子區與GABPB1-AS1在chr15:50655684-50655705位置存在強結合點，同時miR-101種子區在PGC-1α的3'UTR有結合位點（http:// www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_72）（圖2A）。

采用RNA pull down實驗，利用體外轉錄的GABPB1-AS1結合HUVEC細胞中內源miR-101，qRT-PCR檢測與GABPB1-AS1結合的miR-101。結果顯示，與GABPB1-AS1結合的miR-101顯著高于對照組（P＜0.01，圖2B）。

分別采用miR-101的mimic和inhibitor轉染HUVEC細胞，western bloting檢測轉染mimic和inhibitor的 HUVEC細胞中PGC-1α蛋白水平。結果表明，轉染miR-101 mimic的HUVEC細胞中PGC-1α蛋白水平低于空白對照組；轉染inhibitor的HUVEC細胞中PGC-1α蛋白水平高于空白對照組（圖2C）。

以上結果提示，存在GABPB1-AS1/miR-101/PGC-1α調控軸，在氧化應激刺激下，GABPB1-AS1半衰期延長，在細胞質內含量升高，通過“海綿效應”競爭性結合miR-101，解除miR-101結合于PGC-1α mRNA的3'UTR區域的翻譯抑制作用，促進PGC-1α mRNA翻譯，提高PGC-1α蛋白水平（圖2D）。

圖2 GABPB1-AS1競爭結合miR-101上調PGC-1α蛋白質翻譯 Figure 2.GABPB1-AS1 Competitively Binds to miR-101 to Up-regulate the Translation of PGC-1α

2.3 氧化應激高表達的GABPB1-AS1對GABPB1 mRNA的穩定性和蛋白水平的調控作用

采用200 μM的H2O2處理3 h后，去除H2O2，繼續培養細胞，qRT-PCR檢測2 h、4 h、8 h、16 h、24 h的GABPB1-AS1及其正義鏈的RNA水平，western bloting檢測對應的GABPB1蛋白水平。結果顯示，GABPB1-AS1與其正義鏈mRNA表達水平協同性改變，2～4 h維持高表達水平，但GABPB1蛋白水平降低，8～24 h GABPB1正反義鏈mRNA均逐漸降低至基線水平左右，而GABPB1蛋白升高（圖3A）。

構建載體在HUVEC細胞中直接過表達GABPB1-AS1，結果表明，GABPB1 mRNA和蛋白質水平均顯著下降（圖3B）。

生物信息學分析表明，GABPB1-AS1與其正義鏈的前端有449 nt的互補序列，其中包含GABPB1基因的第一外顯子序列全長（1～424 nt）（圖3C）（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/100129387），提示，GABPB1-AS1可能與其正義鏈在細胞質中以互補結合的二聚體形式存在，并調節其正義鏈的穩定性和表達行為。

采用RNA pull down實驗，利用體外轉錄的生物素標記的GABPB1-AS1 mRNA的前端1～447 nt序列結合內源GABPB1以驗證二者的結合關系，同時用RPA試驗檢測正反義鏈重疊聚合狀態對RNaseA+T降解GABPB1 mRNA的保護作用，分析GABPB1-AS1與GABPB1 mRNA的結合性、結合位點以及對mRNA穩定性的影響。結果表明，體外轉錄的GABPB1-AS1與內源GABPB1 mRNA可以在1～447 nt區域直接結合，結合反義鏈的GABPB1 mRNA水平與加入RNase抑制劑的GABPB1 mRNA水平無顯著差異，而單鏈GABPB1 mRNA被RNase降解而顯著降低。證明內源性正反義鏈也處于結合狀態，GABPB1 mRNA與其反義鏈形成二聚體結構可以促進其穩定性，防止被RNase降解（圖3D）。

以上結果提示，氧化應激誘導GABPB1-AS1及其正義鏈mRNA高表達，二者重疊區域互補結合，維持GABPB1 mRNA穩定，應激結束后，GABPB1-AS1半衰期恢復，加速降解，釋放GABPB1 mRNA翻譯，上調其蛋白水平（圖3E）。

圖3 氧化應激狀態GABPB1-AS1結合GABPB1 mRNA保持其穩定并調控其應激后表達 Figure 3.GABPB1-AS1 Binds to GABPB1 mRNA to Maintain its Stability and Regulate its Expression after Oxidative Stress

3 討論

本研究實驗證據表明，氧化應激誘導高表達的LncRNA GABPB1-AS1在應激結束后調控適應階段的PGC-1α翻譯水平上調，其機制是通過海綿作用吸附miR-101，解除其對PGC-1α mRNA翻譯的抑制作用。同時，本研究顯示，LncRNA GABPB1-AS1是核質互作信號分子。氧化應激條件下GABPB1-AS1維持其正義鏈mRNA穩定，應激結束后釋放正義鏈mRNA表達蛋白，其生理意義為調控GABPB1 mRNA翻譯和NRF2入核，協同PGC-1α調節適應性線粒體生成。這是人類特有的應激適應性線粒體生成機制。

細胞氧化應激狀態是運動應激的直接結果和基本狀態（Thirupathi et al.,2017），運動應激誘導的活性氧（ROS）是運動適應性調控的重要信號途徑（Radak et al.,2013），線粒體生成和抗氧化適應是運動性適應的標志性特征（Perry, 2017）。PGC-1α是調控線粒體生物合成的關鍵調節蛋白，能夠激活大量線粒體代謝功能與抗氧化功能相關蛋白的表達（Petr et al.,2018），運動應激可以通過上調PGC-1α途徑啟動線粒體生成（孫易 等 2017）。研究表明，多種因素導致的氧化應激及化學損傷性應激均可以顯著上調GABPB1-AS1細胞含量，上調程度與應激強度和持續時間成正比（Alkhateeb et al.,2019）。我們研究了應激因素消除后GABPB1-AS1的表達行為及其對適應性線粒體生成的調控作用。實驗結果表明，氧化應激誘導高表達的GABPB1-AS1含量在應激因素消除后逐漸下降，最終恢復至基線水平，在此過程中，PGC-1α蛋白水平增高。過表達GABPB1-AS1具有相同的作用，而敲低GABPB1-AS1則抑制PGC-1α蛋白水平。前期試驗結果表明：200 μM的H2O2刺激HUVEC細胞3 h對PGC-1α的mRNA水平沒有顯著影響，提示，GABPB1-AS1在轉錄后水平促進PGC-1α的表達。生物信息學分析表明，miR-101在GABPB1-AS1序列及PGC-1α mRNA的3'UTR上均有結合位點。已有研究表明，miR-101參與神經細胞氧化應激應答（Li et al.,2015）。本研究采用RNA pull-down實驗證明，GABPB1-AS1與miR-101可以互補結合。并且證明，上調miR-101表達可以下調PGC-1α蛋白水平，抑制miR-101水平則PGC-1α蛋白水平上調。綜合以上結果認為，miR-101可以通過結合于PGC-1α mRNA的3'UTR抑制其翻譯過程，GABPB1-AS1是定位于細胞質的RNA，與miR-101互補結合，應激狀態下細胞質內高水平的GABPB1-AS1競爭性吸附miR-101，解除其對PGC-1α翻譯的抑制作用，上調其蛋白水平。

GABPB1-AS1的正義鏈編碼核呼吸因子-2β1亞基（NRF-2β1，又稱為GA結合蛋白β1亞基，即GABPB1）促進線粒體基因表達（Ongwijitwat et al.,2006）并引導NRF-2入核（Hayashi et al.,2013）與PGC-1α蛋白共同調節多數線粒體能量代謝基因的表達，促進線粒體生物合成（Goffart et al.,2003），直接影響人體有氧運動能力（He et al.,2015; Maciejewska-Kar?owska et al.,2012），是重要的線粒體核質互作調控因子。研究表明，多種因素引起的氧化應激均可以引起GABPB1-AS1顯著高表達（Tani et al.,2014）。本研究證實，氧化應激條件下GABPB1-AS1與GABPB1表達水平協同上調，并在應激因素消除后協同下降，但僅過表達GABPB1-AS1則會下調GABPB1的mRNA和蛋白質表達水平。這一結果提示，GABPB1-AS1作為信號分子參與細胞核質互作機制對氧化應激的應答，維持GABPB1 表達水平與線粒體功能狀態相協調。

LncRNA反義鏈通常會通過互補結合對其正義鏈及其表達產物產生調控作用，影響其mRNA的穩定性以及翻譯行為（Canzio et al.,2019）。生物信息分析顯示，GABPB1-AS1與其正義鏈在頭部有449個堿基互補（chr15：50354959～50355408），二者可以通過堿基互補配對形成二聚體結構。本研究RNA pull down實驗和RPA實驗結果證實，GABPB1-AS1與其正義鏈前端1～447 nt互補重疊形成二聚體結構，這一結構防止GABPB1 mRNA被RNase降解，維持其在氧化應激狀態下的穩定性。相比于應激結束后從頭表達GABPB1，這一方式更有利于快速調節線粒體適應（de Nadal et al.,2011）。

本研究結果顯示，H2O2刺激后2～8 h，GABPB1-AS1和GABPB1 mRNA水平均顯著增高，但GABPB1蛋白水平下降，16～24 h GABPB1-AS1和GABPB1 mRNA水平下降，而GABPB1蛋白水平顯著增高。這一結果提示我們，GABPB1-AS1與其正義鏈的二聚體結構在穩定GABPB1 mRNA的同時也阻止其翻譯，其生理意義可能是在細胞受氧化應激影響導致內環境尚未恢復穩態的條件下儲備mRNA的同時，防止蛋白質發生修飾或折疊錯誤。當內環境穩態恢復后，GABPB1-AS1半衰期逐漸恢復，加速降解，釋放出正義鏈mRNA結合核糖體進行翻譯，使GABPB1蛋白水平顯著提高，促進NRF-2入核，協同PGC-1α調節線粒體生成。氧化應激適應過程中GABPB1-AS1半衰期調節及其對GABPB1 mRNA的釋放作用的具體機制，還有待進一步闡明。

4 結論

氧化應激誘導高表達的LncRNA GABPB1-AS1在應激適應階段通過GABPB1-AS1/miR-101/PGC-1α軸上調PGC-1α蛋白水平，調控應激適應性線粒體生成，GABPB1-AS1作為核質互作信號分子參與氧化應激適應性應答，調控其正義鏈編碼蛋白GABPB1協同促進這一過程。GABPB1-AS1參與調控的線粒體生成調控機制是人類特有的應激適應機制。