蔓三七莖多糖理化性質及抗氧化和免疫調節研究

胡居吾，羅 斌，吳 磊，涂招秀，謝 欣

1江西省科學院應用化學研究所，南昌 330096；2江西省食品檢驗檢測研究院，南昌 330001

蔓三七(GynuraProcumbens)，又名平臥菊三七，為多年生草本植物，2012 年 5月被國家衛生部批準為新資源普通食品。蔓三七莖葉營養豐富，富含粗多糖和綠原酸等成分。民間利用其消炎止咳，通經活絡，消腫止痛，現代生物化學和醫學研究證明，蔓三七具有保肝[1]、降壓[2]、調脂降糖[3]、抗炎鎮痛[4-7]、抗癌[8-10]等多種藥理活性。另一方面，其具有極好的營養價值，蔓三七葉是一種藥食兼可的獨特植物，它和現在人們食用的木耳菜同屬。食味柔滑，清香可口?？汕宄?、涼拌、氽湯，其葉也可生吃，或取鮮葉開水沖泡當茶飲，是一種高經濟價值的“藥食兩用”植物。但是，由于蔓三七葉占整株植物的28%，蔓三七莖占目前68%，這部分作為廢棄物處理，目前還沒有得到很好利用。

本實驗以水提醇沉法提取蔓三七莖多糖，研究了蔓三七莖多糖的理化性質，首次應用 GC 分析蔓三七莖多糖的單糖組成；評價了蔓三七莖多糖的抗氧化活性(包括總抗氧化能力、DPPH和 OH自由基的清除能力)；最后，初步探討了蔓三七莖多糖對細胞的免疫調節活性，旨在為蔓三七葉的綜合開發和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七莖，江西華紫仁農業開發有限公司，烘干、粉碎后過20目篩備用。

阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖均購自中國食品藥品檢定研究院。三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐均為分析純，肌醇為生化試劑均購自國藥集團；維生素C(Vc)，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國Sigma公司；苯酚、抗壞血酸、水楊酸鈉、三氟乙酸、甲醇、鹽酸羥胺、溴化鉀、硫酸亞鐵、濃硫酸、葡萄糖均為分析純，購自綿陽市信捷商貿有限公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜儀GC-2010(SHIMADZU公司)，檢測器：FID；色譜柱：WondaCap5毛細管柱 (0.25 mm×30.0 m×0.25 μm)；自動進樣器AOC-20S(SHIMADZU公司)；自動注射器AOC-20i(SHIMADZU公司)。傅立葉紅外光譜儀FTIR-7600(lambad公司)；壓片機DF-4型(天津港東科技發展股份有限公司)；UV-1800 紫外可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q型超純水制備系統，美國Millipore公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090Z型真空干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司。TGL-16GA CO2培養箱，美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 蔓三七莖粗多糖(GPSCP)提取工藝流程[11]

取蔓三七葉烘干、粉碎、過篩，按照一定料液比1∶15加入蒸餾水，于65 ℃恒溫水浴2.5 h，然后采用抽濾方式分離。濾渣部分繼續用同樣方法浸提，上清液合并濃縮后緩慢加入4倍體積的無水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃低溫靜置24 h，再以4 800 rpm離心10 min，收集下層粗多糖沉淀，最后用無水乙醇洗滌2次，得蔓三七粗多糖，測定的蔓三七葉粗多糖得率。

1.3.2 蔓三七莖多糖(GPSP)純化工藝流程

采用Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)進行脫蛋白，重復操作6次后，溶液體系在旋轉于蒸發儀上(45 ℃，-0.01 MPa)除去殘留的Sevage試劑。再配成10 mg/mL的多糖溶液，裝入截留分子量為3 000 u的透析袋中透析24 h，收集透析袋內的多糖溶液，冷凍干燥制得蔓三七莖多糖(GPSP)樣品。

1.3.3 蔓三七莖多糖總糖含量測定

1.3.3.1 多糖含量的測定

采用趙會然的苯酚-硫酸法[21]，體系略作改動。在490 nm處的吸光度，得到回歸方程為y=7.55x-0.078，R2=0.999 4，表明總糖在0.021～0.166 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

樣品液按上面步驟得糖濃度，按下式計算多糖提取量：

多糖提取量(mg/g)=(C×V×N)/1 000M

式中:C—多糖濃度(μg /mL)，V—提取液總體積(mL)，N—稀釋倍數，M—干粉重量(g)。

1.3.3.2 方法學考察

1.3.3.2.1 精密度

取0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液，按上述的方法進行測定，平行六份，計算吸光度的RSD值。

1.3.3.2.2 重復性

稱取六份蔓三七莖粗多糖樣品，分別配制成0.2 mg/mL的供試品溶液，按上述的方法測定其吸光度，計算多糖總糖含量的RSD值。

1.3.3.2.3 穩定性

精密稱取六份蔓三七莖粗多糖樣品，按上述的方法測定吸光度，每15 min，測定一次，在2 h內顯色穩定，計算吸光度的RSD值。

1.3.3.2.4 加樣回收率

取已知含量的六份蔓三七莖粗多糖樣品，精密加入等量的無水葡萄糖，制成供試品溶液，按上述的方法測定吸光度，計算加樣回收率。

1.3.4 GPSP中單糖組成(GC分析)[12]

1.3.4.1 標準單糖衍生物的制備

精密稱取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖標準品各10 mg，分別放入10 mL具塞試管中，分別往各具塞試管中加入鹽酸羥胺10 mg和內標8 mg，再分別加入吡啶0.5 mL，蓋上塞子，在振蕩機上搖勻，然后放入水浴鍋中于90 ℃下加熱反應30 min，在反應時間內間歇振蕩。反應結束后，取出后冷卻至室溫，最后往各具塞試管中加入0.5 mL醋酸酐，繼續放入水浴鍋中于90 ℃下加熱反應30 min。取下塞子后于70 ℃水浴中將試管中的溶液蒸發至干，得到的固體物質加入1 mL氯仿震蕩溶解完全后，取樣進行氣相色譜分析[15]。

1.3.4.2 多糖的水解和衍生化

多糖的水解：精密稱取GPSP樣品50 mg于50 mL旋蒸瓶中，加入4 mol/L的三氟乙酸溶液5 mL，加玻璃塞封口。振蕩使多糖溶解。在100 ℃下水解6 h，取出于70 ℃溫度下旋轉蒸發至干。

多糖的衍生化：水解后的多糖，按照“1.3.4.1”項下標準單糖衍生化的方法分別衍生化。

1.3.4.3 氣相色譜分析

氣相色譜條件設置：氫氣流量40.0 mL/min，空氣流量400 mL/min，氮氣吹尾流量30.0 mL/min，進樣壓力100.0 kpa；進樣溫度為240 ℃，檢測器溫度為260 ℃，色譜柱初始溫度為140 ℃，維持3 min，以10 ℃ /min升至240 ℃，維持15 min，進樣體積為 1 μL。

1.3.4.4 重復性考察

精密稱取6 份GPSP樣品50 mg，按1.3.4.2“多糖的水解和衍生化”項下操作，取1 μL樣進行氣相色譜分析，記錄各峰面積，計算鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的峰面積，RSD分別為：0.98%、1.18%、1.23%、0.89%、1.17%、1.04%。結果表明本研究方法重復性良好。

1.3.4.5 穩定性試驗

取供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、6、8、12、24 h，取1 μL，按“1.3.4.4”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，峰面積的RSD分別為1.35%、1.46%、2.43%、2.58%、2.64%、1.89%。結果表明，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的衍生化產物在 24 h 內穩定性良好。

1.3.4.6 單糖組成

按下列公式計算GPSP中單糖質量，并求得相應單糖的摩爾數。

式中m0、mr、ms分別表示待測單糖、單糖標準品和內標物質的質量，A0、Ar、As分別表示待測單糖、單糖標準品和內標物質的峰面積，f表示相對校正因子。

1.3.5 紅外光譜分析[13]

取少量干燥后的GPSP粉末，往其中加入適量的溴化鉀晶體，在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨，至極細粉末，用壓片機壓制成透明薄片，經顯微紅外光譜儀400 cm-1～4 000 cm-1中紅外區掃描。

1.3.6 GPSP的抗氧化活性測定

1.3.6.1 總抗氧化能力的測定[14]

采用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒測定GPSP總抗氧化能力。分別準確配制不同濃度的GPSP和抗壞血酸(Vc)溶液樣品，按照T-AOC測定試劑盒說明書進行操作。在520 nm測定管樣品吸光度(A測定)和對照管吸光度(A對照)，根據下列公式計算GPSP及Vc的總抗氧化能力(η總):

式中:

N—反應體系稀釋倍數(反應液總量/取樣量)；

n—樣品測試前稀釋倍數。

在37 ℃時，每分鐘每毫升樣品使反應體系的吸光度值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測定[15]

分別取不同濃度的GPSP和抗壞血酸(Vc)溶液2 mL，加入2 mL的DPPH乙醇溶液，混勻后室溫放置30 min后，在517 nm處的吸光度(A1)。同時測定不加DPPH的多糖溶液與乙醇混合后的吸光度(A2)，不加樣品的DPPH乙醇溶液作為空白對照的吸光度(A0)。根據公式計算GPSP及Vc的DPPH自由基清除率(ηDPPH·):

1.3.6.3 OH自由基清除能力的測定[16]

取0.5 mL 2 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液，往其中加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.5 mL，再分別加入1.5 mL不同濃度GPSP溶液和抗壞血酸(Vc)溶液，最后加入0.5 mL 6 mmol/L雙氧水。在510 nm下測定吸光度(Ax)。同時測定用蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液的吸光度(Ay)，蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照的吸光度(A0)。根據下列公式計算GPSP及VC的OH自由基清除率(η·OH):

1.3.7 細胞培養和藥液配制

RAW 264.7 細胞購于美國典型培養物保藏中心(ATCC)。RAW 264.7 細胞用RPMI 1 640培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)在恒溫37 ℃、5% CO2培養箱中培養至對數生長期。將GPSP溶解于二甲基亞砜試劑(DMSO)中，用RPMI 1 640培養基稀釋成供試液濃度，所配制的藥液中DMSO含量不能超過0.1%。

1.3.8 細胞活性檢測-MTT法

采用MTT法[17]檢測細胞存活率。選取對數生長期RAW 264.7細胞，按1×106個/mL、100 μL/孔接種于96孔板中，置于CO2培養箱培養過夜后，吸取舊培養基，加入待測藥物的新培養基繼續培養24 h，吸取舊培養基，于每孔中加入MTT工作液100 μL，繼續孵育3 h后每孔加入MTT終止液100 μL繼續培養16～20 h后，用酶標儀在550 nm處測定OD值，實驗重復3次，計算細胞的相對存活率。

細胞的相對存活率(%)=(實驗組孔吸光值-空白

組孔吸光值)/(實驗組孔吸光值-空白組孔吸光值)

1.3.9 對RAW264.7細胞NO、PEG2和TNF-α分泌的影響[18]

將密度為1×105個/mL細胞接種于96孔板中，每孔100 μL置于CO2培養箱中培養過夜，洗掉舊培養基，加入不同濃度供試藥物的新培養基繼續培養24 h，以加入1 μg/mL LPS處理的細胞作為陽性對照組。檢測細胞上清液中NO的分泌量，按ELISA檢測試劑盒操作方法測定TNF-α及PGE2的分泌量。

1.3.10 數據處理

實驗數據以x±s表示，采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS13.0軟件進行方差分析，P<0.05表示組間有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 方法學考察及多糖樣品測定結果

精密度實驗結果表明，葡萄糖對照品的吸光度RSD值為1.87%，說明本研究采用的UV-1800紫外可見分光光度計精密度良好；重復性實驗結果表明，供試品總糖含量的RSD值為2.35%，說明該方法重復性良好；穩定性結果顯示該方法在2 h內穩定，RSD值為0.65%；回收率實驗結果顯示加樣回收率范圍96.65%～104.12%，RSD為1.89%。

2.2 GPSP中糖醛酸、硫酸根、蛋白質含量的測定

通過測定，蔓三七葉多糖的得率、含量及蔓三七葉多糖中的糖醛酸、硫酸根、蛋白質含量見表1。

表1 蔓三七莖多糖(GPSP)的相關基本成分

與其他提取多糖方法(如堿提法、酶提法)相比，水提醇沉法獲取的糖醛酸及硫酸根含量較低，因為，稀堿溶液能使蔓三七莖細胞壁致密結構變得疏松，打斷了葡萄糖醛酸與半纖維素或纖維素之間分子的連接，從而使糖醛酸溶于稀堿溶液中，故堿提法得到糖醛酸和硫酸根含量最高。酶提法在一定程度上會破壞纖維素、半纖維素的結構，減少糖醛酸基團在溶劑中的暴露，故纖維素酶法得到的糖醛酸含量低于堿法提；水法提取其中的水溶性多糖，故糖醛酸和硫酸根含量均較低。蔓三七莖除含有多糖類外，還含有蛋白質、礦物質、維生素等。

2.3 單糖組成

本研究首次采用GC分析鑒定了GPSP的單糖組成，采用鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙?；苌ㄓ行Э朔捎诙嗵堑漠悩嫽斐傻亩喾瀣F象，使得每種單糖都能獲得單一的色譜峰，有利于進行氣相色譜的定性和定量分析。圖1和圖2表明，GPSP主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成。其中，木糖含量最大，半乳糖和阿拉伯糖次之，六種單糖的摩爾比為1.69∶4.64∶9.17∶1.00∶1.92∶4.85。

圖1 標準單糖氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of complex monosaccharide derivative注：1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.肌醇。Note:1.Rhamnose;2.Arabinose;3.Xylose;4.Mannose;5.Glucose;6.Galactose;7.Inositol.

圖2 GPSP氣相色譜圖Fig.2 GC chromatogram of polysaccharide from Gynura procumbens stem注：1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖。Note:1.Rhamnose;2.Arabinose;3.Xylose;4.Mannose;5.Glucose;6.Galactose.

2.4 光譜分析

紅外光譜是研究聚合物結構和化學鍵，表征不同化合物的常用手段之一，具有高度的特征性，一種有效研究分子官能團特征的手段。圖3結果顯示，GPSP在3 409.529 cm-1處出現的寬峰為分子間和分子內羥基(O-H)伸縮振動特征峰。2 964.053 cm-1處吸峰收為糖鏈中飽和甲基或亞甲基(C-H)伸縮振動峰，1 614.126 cm-1處吸峰收為 C=O伸縮振動峰。1 398.138 cm-1處吸收峰為C-H的變角振動峰。1 043.300 cm-1處吸收峰可能是吡喃糖環的特征吸收峰[19]。

圖3 GPSP的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.5 GPSP的抗氧化活性

2.5.1 總抗氧化能力

不同質量濃度GPSP樣品總抗氧化能力研究結果見圖4。由圖4可見，GPSP的總抗氧化能力隨著溶液濃度增大，抗氧化能力隨之增強，與Vc在不同質量濃度的總抗氧化能力走向趨勢相同。當GPSP樣品質量濃度為5.00 mg/mL時，GPSP的總抗氧化能力達到了11.96±0.50 U/mL，達到相同質量濃度的Vc總抗氧化能力2.65±0.66 U/mL的95.0%以上?？梢钥闯?，GPSP總抗氧化能力較強。

圖4 GPSP總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capability of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.5.2 對DPPH自由基清除能力

不同質量濃度GPSP對DPPH自由基清除能力實驗結果見圖5。GPSP與Vc的DPPH 自由基清除能力均隨著質量濃度增大具有增強趨勢。各濃度GPSP對DPPH 自由基清除能力低于同質量濃度下Vc對DPPH 自由基清除能力。但是，各質量濃度下的GPSP對DPPH 自由基清除效果也很明顯，在濃度為4 mg/mL時，對DPPH 自由基清除率高達63.4%±2.36%，在此質量濃度下GPSP清除DPPH自由基的IC50為2.76±0.17 mg/mL。說明GPSP對DPPH自由基清除能力較好，盡管GPSP對DPPH自由基的清除能力低于Vc，但由于其良好的抗氧化活性和無任何毒性，可開發一種天然的抗氧化劑。

圖5 GPSP對DPPH自由基清除能力Fig.5 The scavenging effect on DPPH free radical of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.5.3 對OH自由基清除能力

不同質量濃度GPSP對OH自由基清除能力實驗結果見圖6。GPSP與Vc的OH自由基清除能力均隨著質量濃度增大具有增強趨勢。各濃度GPSP對OH自由基清除能力低于同質量濃度下Vc對OH自由基清除能力。但是，各質量濃度下的GPSP對OH自由基清除效果也很明顯，在濃度為5 mg/mL時，GPSP對OH自由基清除率為68.12%±1.12%，在此質量濃度下GPSP清除OH自由基的IC50為1.43±0.11 mg/mL，說明GPSP對OH自由基清除效果較好。

圖6 GPSP對OH自由基清除能力Fig.6 The scavenging effect on OH free radical of polysaccharide from Gynura procumbens stem

2.6 對炎癥因子釋放的影響

圖7 GPSP對RAW 264.7細胞存活率及炎癥因子含量的影響 Fig.7 The effects of GPSP on cells viability and the contents of cytokines secretion in RAW 264.7

本實驗采用MTT法檢測GPSP在一定的質量濃度范圍內對RAW 264.7細胞存活率的影響，以考察GPSP的安全性。研究結果如圖7(A)所示，樣品濃度在12.5～100 μg/mL范圍內，RAW 264.7細胞存活率所呈現的趨勢與空白對照組相比基本一致，這說明GPSP在濃度12.5～100 μg/mL范圍內對RAW 264.7細胞并無毒性。但是，當樣品濃度在200 μg/mL時，RAW264.7細胞存活率所呈現的下降趨勢。

由免疫和非免疫細胞分泌細胞因子是細胞間的信號分子，在免疫反應中起到重要的作用?；罨木奘杉毎軌蜥尫糯罅康募毎蜃?比如NO)。這些炎癥因子在細胞毒性/抑制細胞生長的機制中發揮著重要的作用[20]。因此，本研究中將NO的釋放水平作為免疫刺激中巨噬細胞活化的指標之一。采用Griess試劑法測定NO的含量，實驗結果如圖7(b)所示，正常組中RAW264.7細胞只釋放少量的NO(3.03±0.11 μM)，隨著加入的GPSP樣品濃度的增加，RAW264.7細胞釋放NO的含量逐漸增加，并呈現出濃度依賴性關系。在GPSP樣品濃度為50.0 μg/mL 時，NO的分泌量達到最大(39.28±3.25 μM)。另一方面，在樣品濃度在12.5～100 μg/mL范圍內，RAW264.7細胞釋放NO的含量比LPS組低，說明GPSP比LPS更溫和，適合作為免疫調節劑。

3 結論

苯酚-硫酸法是常用的測定多糖含量的方法，結果表明該方法重復性、穩定性好。采用氣相色譜法(GC)分析測定GPSP中單糖組成，實驗結果表明單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為1.69∶4.64∶9.17∶1.00∶1.92∶4.85。該方法具有簡便靈敏、衍生物雜質少、精密度高、重復性好等優點，能準確測定出GPSP中單糖的組成，具有較強的適用性。體外抗氧化活性結果證實GPSP對總抗氧化能力、DPPH自由基、OH自由基的清除能力具有較好的清除效果，并表現出明顯的量效關系。

采用MTT法檢測研究GPSP對RAW264.7 細胞活性的影響時，在GPSP樣品濃度12.5～100 μg/mL范圍內，細胞存活率所呈現的趨勢與空白對照組相比基本一致，這說明GPSP在濃度12.5～100 μg/mL范圍內對RAW264.7細胞并無毒性?？傮w而言，蔓三七莖多糖的抗氧化活性和免疫調節較強。下一步的研究工作主要集在對蔓三七莖粗多糖進行進一步純化，再詳細探討其免疫調節機制，并使蔓三七莖多糖的免疫功效效果得到更詳實的數據。