小白及多糖提取、脫蛋白工藝及抗氧化性研究

宋志姣，湯 丹，李 悅，章金龍，羅旺全，項 輝，馬前濤

保山學院資源環境學院，保山 678000

多糖類化合物是真菌、動物、植物細胞膜和細胞壁的主要成分，研究表明這種高分子聚合物在免疫調節、抑制腫瘤、抗病毒、抗氧化等方面均有顯著生物活性[1-3]。多糖類藥物毒副作用小、生物活性隨著純度的提高而顯著增加[4]，我國已有茯苓多糖(國藥準字B20050015)等多糖類藥物問市。目前，真菌多糖是國內外研究的熱點，對藥用植物多糖成分的研究較少[5]。對于富含多糖的小白及，其研究主要集中在內生菌[6]、組織培養與快速繁殖[7]、白及屬植物鑒定[8]等幾個方面。蔡錦源對同屬白及Bletillastriata(Thunb.ex A.Murray) Rchb.f.的研究認為：白及多糖和真菌多糖一樣具有較好的抗氧化能力[9,10]。

小白及Bletillaformosana(Hayata) Schltr.又名小白芨、三叉白及，是蘭科(Orchidaceae)白及屬(Bletilla)多年生草本植物[11]，以干燥假鱗莖入藥，具有消腫止血、收斂和生肌的功效[12]。小白及廣泛分布于我國西南各省區，歷來為少數民族重要的習用藥材[13]，其適應能力強、抗逆性好，是易于進行林-藥復合經營的藥用植物；植株形態優美、花色艷麗，是美麗鄉村建設的潛在園林園藝植物?，F代醫學研究表明小白及含有豐富的白及膠，其中的多糖、聯芐類、二氫菲類等是小白及主要藥用活性成分[14-16]。本研究以多糖得率為指標，探索微波輔助提取小白及假鱗莖多糖的最佳工藝，并比較3種脫蛋白工藝的效果；初步考察小白及粗多糖和精制多糖的抗氧化活性。研究結果為小白及多糖為主要活性成分的藥品和天然食品添加劑的研究應用提供參考，為富含多糖藥用植物的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白及：購于保山市隆陽區農民街藥材市場，樣品經過保山學院汪建云教授、保山中醫藥高等?？茖W院楊發建、廣西大學蒙奕奕博士共同鑒定。

無水乙醇、葡萄糖標準品、牛血清蛋白、苯酚、考馬斯亮藍、維生素C、鐵氫化鉀、DPPH、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、濃硫酸、正丁醇、氯仿、磷酸鹽緩沖液、鐵氫化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、Tris-HCl緩沖溶液、鄰苯三酚、濃鹽酸、茯苓多糖(國藥準字B20050015，湖南補天藥業有限公司)、胰蛋白酶(酶活力為10 000 U/g，和氏璧生物科技有限公司)等。

1.2 儀器

DHG 9140A烘箱(上海恒一有限公司)、FF-1000A粉碎機(常州市偉嘉儀器制造有限公司)、CP214電子天平(奧豪斯儀器有限公司)、G70F20N2L-DG微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)、HH-4數顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵(上海子華生物科技有限公司)、OSB-2100旋轉蒸發儀(上海泉杰儀器有限公司)、TDL 5A離心機(上海安亭)、UV2600紫外-可見分光光度計(日本島津)、20目標準篩(浙江上虞市道墟五四儀器廠)、YCD-DL259電冰箱(中科美菱低溫科技有限公司)、三角瓶、容量瓶等。

1.3 試驗方法

1.3.1 小白及多糖提取條件研究

材料預處理：小白及假鱗莖洗凈、切片、烘干、粉碎，過20目標準篩后密封備用。單因素實驗：精確稱取小白及粉末2.000 0 g，置于100 mL三角瓶中，按料液比1∶20(m∶v，g/mL，下同)加入50 ℃溫水，其余4個因素設定為微波額定功率700 W的40%，微波時間為60 s，浸提溫度80 ℃，浸提時間2 h，固定其中3個因素，依次對微波額定功率700 W的不同百分比(20%、40%、60%、80%、100%)、微波時間(30、40、50、60、70 s)、浸提溫度(50、60、70、80、90 ℃)、浸提時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)進行單因素實驗，提取并浸提3次，參考楊翠嫻[17]的方法合并、濃縮、沉淀和離心提取物，將離心后所得多糖烘干至恒重，采用稱質量法測定小白及多糖的得率，重復3次。

按照下式計算多糖得率：

多糖得率(%)=(多糖干品質量/原料質量)×100%

最優工藝條件正交試驗：結合單因素實驗結果，參考L9(34)正交試驗表進行正交試驗，正交試驗因素及水平如表1，其余步驟相同。

1.3.2 粗多糖脫蛋白工藝研究

1.3.2.1 脫蛋白工藝

Sevag法脫蛋白工藝參考王琳煒[18]。酶法脫蛋白工藝依次對不同水平的酶解溫度(20、30、40、50、60 ℃)、酶加量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL)、酶解時間(30、40、50、60、70 min)進行單因實驗，酶解后置沸水浴滅酶10 min，常溫下離心10 min，5 000 rpm后取上清液測定蛋白含量，探討不同脫蛋白參數對小白及粗多糖蛋白脫除率及多糖損失率的影響[18]；結合單因素實驗的結果進行正交試驗探討最佳脫蛋白工藝。酶-Sevag法聯用脫蛋白工藝在酶法所得最優條件下進行，離心后的上清液采用Sevag法進行重復多次脫蛋白，直至無明顯沉淀，測定蛋白質和多糖的吸光度。

表1 正交試驗因素及水平

1.3.2.2 蛋白脫除率和多糖損失率測定

參考文獻[18]的方法測定蛋白脫除率，于595 nm波長處測定濃度梯度標準液吸光度(A595nm)，以牛血清白蛋白溶液濃度(mg/mL)為橫坐標，A595 nm為縱坐標，得一元線性回歸方程：Y=17.943X+0.000 5，R2=0.995 9。

蛋白質脫除率按下式計算：

蛋白質脫除率(%)=(Ri-Rj)/Ri×100%

式中：Ri、Rj分別代表所得小白及粗多糖脫蛋白前、后蛋白質含量(mg/mL)。

參考文獻[18]的方法測定多糖損失率，于490 nm波長處測定濃度梯度標準液吸光度(A490 nm)，以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，A490 nm為縱坐標，得一元線性回歸方程：Y=10.48X，R2=0.999 1。

多糖損失率按下式計算：

多糖損失率(%)=(Ti-Tj)/Ti×100%

式中：Ti、Tj分別代表所得小白及粗多糖脫蛋白前、后多糖含量(mg/mL)。

1.3.3 多糖抗氧化性研究

1.4 數據處理

所有數據采用Microsoft Excel 2016繪制圖表，用SPSS 16.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 微波輔助提取小白及多糖

2.1.1 微波功率

測定結果表明，在微波功率小于額定功率的40%時，多糖得率隨額定功率百分比的增加而增大；微波功率為額定功率的40%時，多糖得率最大，此時多糖得率為32.50%。微波會使分子的熱運動增加，破碎細胞壁，在較短時間內使小白及多糖溶出。當微波額定功率大于40%時，多糖得率顯著下降，這可能是由于微波不斷增強，部分多糖因過度加熱而分解，同時雜質溶出增多，在進行醇沉時小分子糖溶解在95%的乙醇溶液中，從而降低了小白及多糖得率[18]。

圖1 額定功率百分比對小白及多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave power percentage on extraction yield of polysaccharide

圖2 微波時間對小白及多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on extraction yield of polysaccharide

2.1.2 微波時間

微波時間小于40 s時，多糖得率與微波時間呈正比，可能是在提取初期，濃度梯度差大，多糖擴散速率快。微波時間為40～60 s，多糖得率變化緩慢，當微波時間為60 s時，多糖得率最大，為36.17%，可能是濃度梯度差減小，擴散減慢。微波時間大于60 s，多糖得率顯著下降，可能是過分加熱導致部分多糖水解加大，使多糖得率下降[17]。

2.1.3 浸提溫度

浸提溫度小于70 ℃，多糖得率與溫度呈正比；當浸提溫度為70 ℃時，多糖得率達到最大值，為25.33%；浸提溫度大于70 ℃，多糖得率顯著下降，其原因可能是溫度過高造成多糖的降解，溫度70 ℃為最佳提取溫度。

圖3 浸提溫度對小白及多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharide

2.1.4 浸提時間

當浸提時間小于2.0 h時，多糖得率隨浸提時間的增大而增大，當浸提時間為2.0 h時，多糖得率達到最大值，為30.5%；當浸提時間大于2.0 h時，多糖得率顯著下降，其原因可能是長時間浸提使材料糊化，多糖難溶出，故浸提時間2.0 h為最佳。

圖4 浸提時間對小白及多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharide

2.1.5 正交試驗優化微波輔助提取小白及多糖工藝

正交試驗的結果表明，工藝為A2B1C2D3的提取方案小白及多糖得率最高，但是從極差分析的結果來看小白及多糖提取的最佳工藝應為：A2B2C2D3。在相同條件下對A2B1C2D3和A2B2C2D3分別進行3次重復提取實驗以驗證結果，表明小白及多糖的平均得率分別為37.67%和38.33%，綜上所述微波輔助提取小白及多糖的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即微波功率為額定功率的40%，微波時間60 s，浸提溫度70 ℃，浸提時間2.5 h。

表2 L9(34)正交試驗結果

以多糖得率為考察指標(表3)，經方差分析可得除了A微波額定功率百分比(%)對多糖得率影響顯著以外，B微波時間(s)、C浸提溫度(℃)和D浸提時間(h)對多糖得率的影響并不顯著，根據顯著性可得影響小白及多糖得率的因素順序為A>D>B>C，即微波額定功率百分比>浸提時間>微波時間>浸提溫度。

表3 正交試驗結果方差分析

2.2 小白及多糖脫蛋白工藝分析

2.2.1 Sevag法脫蛋白結果分析

小白及粗多糖的蛋白脫除率和多糖損失率隨著脫蛋白次數的增加，均呈上升趨勢。在第8次處理之后，小白及粗多糖的蛋白質脫除率為81.73%，多糖損失率達31.73%，采用該方法脫去小白及粗多糖中蛋白質的同時，蛋白質的脫除伴隨著多糖的損失。

圖5 Sevag法脫小白及粗多糖蛋白Fig.5 Efficiency of protein removal by the Sevag method

2.2.2 酶法脫蛋白結果分析

單因素實驗結果表明在底物濃度、催化作用接觸面積一定的情況下，蛋白質脫除反應不會一直隨著酶濃度、酶解時間、酶解溫度的增加而增加，酶加量0.5 mL，酶解時間40 min，酶解溫度40 ℃的條件下蛋白脫除率最高，在最優單因素條件下小白及粗多糖的蛋白脫除率分別為65.59%、63.43%和67.23%。正交試驗結果表明：最佳工藝實驗號為6，既A2B3C1D2，但是從極差分析的結果來看小白及多糖提取的最佳工藝應為：A2B2C1D3。在相同條件下對A2B3C1D2和A2B2C1D3分別進行3次重復提取實驗以驗證結果，兩個工藝的綜合評分分別為72.58%和73.81%，因此酶法脫蛋白的最佳工藝組合為A2B2C1D3，即酶加量0.5 mL，B酶解時間40 min，酶解溫度30 ℃。由極差R分析可知，影響蛋白脫除程度因素按其作用大小排序為B>C>D>A，即酶解時間>酶解溫度>酶添加量。方差分析的結果表明(未列出)：除了A酶加量(mL)對小白及粗多糖蛋白脫除率影響顯著以外，B酶解時間和C酶解溫度對蛋白脫除率影響并不顯著，根據顯著性將影響小白及多糖得率的因素順序為B>C>A>D，即酶解時間>酶解溫度>酶添加量。

表4 L9(34)胰蛋白酶脫蛋白法正交試驗結果

續表4(Continued Tab.4)

實驗號CodeA酶加量Enzyme addition (mL)B酶解時間Enzymatic hydroly time (min)C 酶解溫度Enzymatic hydroly temperature (℃)D空Empty蛋白質脫除率Protein removal rates (%)多糖保留率Polysaccharide retention rates (%)綜合評分Comprehensive evaluation5223164.5779.8972.236231265.3882.4273.907313262.2777.9470.118321363.8379.6271.739332161.6473.2467.44K168.2569.5471.0969.11K272.3471.0769.9468.77K369.7670.1570.2770.58R4.296.466.265.92最優方案A2B2C1D3

2.2.3 酶-Sevag法聯用脫蛋白結果分析

由圖6可知，先用酶法處理后蛋白質脫除率為65.38%，多糖損失率為17.58%，脫除次數大于2次以后蛋白質脫除率無明顯差異，與之相反多糖損失率仍在增加。因此在第5次處理后停止實驗，此時蛋白質脫除率為81.11%、多糖損失率為33.22%。綜合考慮蛋白質脫除率和多糖損失率兩組數據，酶-Sevag法處理2次時蛋白脫除率較高為80.01%，多糖損失率較低為24.58%。

2.2.4 三種脫蛋白工藝比較

圖6 酶-Sevag法脫蛋白Fig.6 Deproteinization efficiency of the combined method

表5 三種脫蛋白工藝最佳參數比較

測定結果表明：采用Sevag法除去小白及粗多糖中的蛋白質，脫除率最高為81.31%，但同時多糖損失率也最高為31.73%；采用酶法除去小白及粗多糖中的蛋白質時，蛋白質脫除率最低為65.41%，同時多糖損失率也最低為17.78%；采用酶-Sevag法時，蛋白質脫除率為80.01%與Sevag法較為接近，同時多糖損失率為24.58%遠低于Sevag法的31.73%。采用酶-Sevag法脫去小白及粗多糖中的蛋白質過程中，胰蛋白酶將粗多糖中的蛋白質降解為小分子氨基酸或者多肽，留在溶液中；而分子量較大的多糖則可通過高速離心獲得沉淀；再結合Sevag法處理2次，既節約了試劑和時間，又降低了多糖損失率，故酶-Sevag法為小白及粗多糖脫蛋白的最優方法。該方法的參數為：酶加量0.5 mL、酶解溫度40 ℃、酶解時間30 min，后置沸水浴中滅酶10 min，取出后離心，上清液采用Sevag法脫蛋白2次。

2.3 小白及多糖的抗氧化性分析

2.3.1 鐵還原能力分析

如圖7所示，小白及粗多糖、三種方法精制多糖、維生素C和茯苓多糖的鐵還原能力皆隨濃度的增大而增大，相同濃度的小白及粗多糖、三種方法精制多糖和茯苓多糖的鐵還原能力低于維生素C，當濃度達到10 mg/mL時小白及粗多糖在700 nm的吸光度為0.863，Sevag制多糖的為0.583，酶制多糖的為0.763，酶-Sevag制多糖的為0.723，維生素C的為5.602，茯苓多糖的為0.633。同濃度下小白及多糖的鐵還原能力低于維生素C，除Sevag法所得多糖以外其余精制方式所得小白及多糖略高于茯苓多糖。

圖7 多糖對鐵的還原能力Fig.7 Scavenging effect on ferric reducing antioxidant power

2.3.2 DPPH自由基的清除能力

圖8 多糖DPPH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effect of WSP on DPPH

5 900.083 μg/mL。說明在相同濃度的情況下，酶法小白及多糖對DPPH自由基的清除能力較好、小白及粗多糖次之。

圖9 多糖的清除能力Fig.9 Scavenging effect of WSP on

3 討論

研究采用微波輔助法提取小白及多糖，在最優工藝條件下小白及多糖的提取率可達38.33%，略高于水提醇沉法提取同屬植物白及的粗多糖得率34.7%[22]；所得提取物采用Sevag法進行處理時脫蛋白率為81.73%，略高于白及的75.86%[22]。微波輔助提取技術耗時短、效率高，適用于小白及多糖提取，可為植物多糖提取提供參考。

4 結論

致謝：本論文得到保山市第八批創新團隊，“藥食同源”產品質量及品牌建設研究創新團隊項目資助(201911)；本論文得到國家留學基金資助。