一株高產Monacolin K紫紅曲霉菌株篩選、鑒定及發酵條件優化

趙 娜，張紅星，謝遠紅，金君華，賈 宇

北京農學院食品科學與工程學院 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室食品質量與安全北京實驗室 微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室，北京 102206

紅曲霉(Monascus)是一類小型絲狀腐生真菌，屬子囊菌亞門(Ascomycotina)不整囊菌綱(Plectomycetes)散囊菌目(Eurotiales)紅曲科(Monascaceae)[1]，某些紅曲霉菌株在培養過程中能夠產生生理活性物質Monacolin K[2,3]。而Monacolin K是HMG-CoA還原酶的抑制劑，具有降低膽固醇的作用[4,5]。

自 20世紀70年代末，日本Endo等[6]發現了紅曲霉代謝產物中降膽固醇活性物質Monacolin K 及其類似物，便有力地促進了紅曲霉Monacolin K相關方面的研究與應用[7]。Monacolin K屬于聚酮類化合物，具有復雜的分子結構，因此化學合成的方法不能應用于大規模的生產[8]，所以采用生物發酵方法是其工業生產的主要途徑之一[9]。目前，液態發酵Monacolin K具有規模大，自動化程度高，人力成本低，生產過程易控制等顯著優點[10]，但由于液態發酵產量低，故需在高產Monacolin K菌株的篩選和工藝優化上取得突破[11]。本實驗從天然發酵的紅曲米中分離30株紅曲霉菌，篩選得到高產Monacolin K菌株，采用正交試驗法優化發酵工藝，以期為高產Monacolin K的紅曲霉微生物發酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

從天然發酵的紅曲米中分離的30株紅曲霉菌株，編號見表2。

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏，均為生物制劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、蔗糖、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉，北京暢華志誠技有限公司；米粉，寧波市江北五橋糧油有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，北京陸橋技術有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，Fisher公司；Monacolin K標準品，青島普瑞邦生物工程有限公司；Taq 聚合酶，寶日醫生物技術(北京)有限公司(takara中國)；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基：PDA培養基。

種子培養基(L)[12]：米粉30 g，葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.5 g，pH自然。

發酵培養基(L)[12]：葡萄糖70 g，牛肉膏15 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.5 g，pH自然。

1.2 主要儀器與設備

BSA2202S型電子天平，賽多利斯工業稱重設備(北京)有限公司；DL-CJ-2ND1型潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；MLS-3750型立式壓力蒸汽滅菌鍋，日本三洋電器股份有限公司；THZ-C型恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司；1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DYY-6D型電泳儀，WD-9413B凝膠成像分析儀，均為北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲霉菌株的篩選

將采樣自福建地區的天然發酵的紅曲米磨碎，以接種環蘸取少量紅曲米接種于PDA培養基平板上，進行連續多次劃線分離，直到產生早期為白色、后期為紅色或紫色的單菌落，再用PDA固體培養基純化培養，將所獲菌株編號，編號見表2，置4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 發酵液Monacolin K產量測定

將所篩菌種接種于PDA斜面培養基，28 ℃恒溫培養6 天。種子液制備：100 mL三角瓶裝入種子培養基50 mL，接種0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊，八層紗布包扎，28 ℃、160 rpm恒溫搖床中培養3 天。液體發酵培養：100 mL三角瓶裝入發酵培養基50 mL，按體積分數7%的接種量接種，八層紗布包扎，28 ℃、160 rpm恒溫搖床中培養7 天。

取2 mL發酵液于50 mL的離心管中，加入8 mL無水甲醇?；靹蚍胖糜趽u床中160 rpm震蕩提取3 h，5 000 rpm離心10 min取上清[13]， 用0.22 μm有機濾膜過濾后通過高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)進行Monacolin K產量測定[14]。

HPLC檢測條件，色譜柱ZORBAX300SB-C18：柱長150 mm；內徑4.6 mm；粒徑5 μm。流動相V(乙腈)∶V(0.01%磷酸)=65∶35；檢測波長237 nm；進樣體積20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

1.3.3 菌株Monacolin K產量穩定性研究

將高產Monacolin K的優勢菌株作為目的菌株進行傳代培養，連續培養10代，通過測定每一代發酵液的Monacolin K產量分析其穩定性，測定方法同上。

1.3.4 菌株鑒定

將目的菌株接種于PDA平板上培養7 天，觀察目的菌株在PDA培養基上菌落形態和顯微結構。采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取紅曲霉基因組DNA[15]，采用PCR方法擴增ITS rDNA基因，引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR反應體系見表1。

表1 紅曲霉菌株PCR反應體系

PCR循環條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min[16]。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST對比分析。將目的菌株送至中國科學院微生物研究所進行微生物菌種鑒定。

1.3.5 發酵條件優化

以發酵液Monacolin K產量為評價指標進行單因素試驗，發酵培養基配方同上，并設定初始培養條件為：發酵溫度為28 ℃，初始pH值自然，接種量為體積分數7%，發酵時間為7 天。對發酵培養的主要影響因素(接種量、發酵溫度、發酵時間、初始pH)進行單因素優化試驗[17]，接種量分別設定為體積分數6%、7%、8%、9%、10%；發酵溫度設定為24、26、28、30、32 ℃；發酵時間分別設定為6、8、10、12、14 天；初始pH值設定為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。測定各條件下發酵液中Monacolin K的產量，每個實驗重復3次。

在此單因素試驗基礎上，設計正交試驗方案如表4。

2 研究結果與分析

2.1 高產Monacolin K紅曲霉菌株篩選

將PDA平板上分批次分離的30株紅曲霉菌株，分別標記菌株代號為ZX1、ZX2…ZX30。分別對30株紅曲霉進行產Monacolin K能力檢測試驗。結果如表2所示，有9株紅曲霉的發酵液在檢測波長237nm處有特征吸收峰，說明具有產Monacolin K的能力；其余21株沒有特征吸收峰，可初步判斷這些菌株不產Monacolin K。9株紅曲霉產Monacolin K能力差異較大，其中編號ZX26菌株產Monacolin K能力最強，達到101.60 mg/L，故在后繼發酵條件優化中選擇編號ZX26為目標菌株。

表2 紅曲霉菌株Monacolin K產量

2.2 紅曲霉ZX26 Monacolin K產量穩定性

將編號為ZX26菌株傳代培養，進行產Monacolin K穩定性試驗，通過測定每一代發酵液的Monacolin K質量濃度，來判斷產Monacolin K穩定性。結果如表3所示。

表3 紅曲霉ZX26產Monacolin K穩定性(連續培養10代)

結果表明，紅曲霉ZX26菌株連續培養10代后，其Monacolin K產量仍然處于較高水平，可以基本判斷ZX26菌株在產Monacolin K能力方面具有良好的穩定性。

2.3 ZX26菌株的形態學鑒定與分子學鑒定

2.3.1 ZX26菌株的菌落形態及顯微特征

將編號為ZX26菌株接種于在PDA平板培養基上28 ℃培養7天，直徑5 cm，紫紅色，絨毛狀，皺裂(圖1a)，反面紫紅色。菌絲具隔膜，多分枝，直徑3～6 μm。閉囊殼球形，直徑25～50 μm(圖1b)，橙紅色至紫紅色。子囊孢子橢圓形，5～6×4～5 μm。分生孢子著生于孢梗頂端，單個或成串，近球形或倒梨形，8～11×6～8 μm(圖1c)。

2.3.2 ZX26菌株的分子測序結果

將編號為ZX26菌株ITS rDNA 基因PCR擴增后的結果送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行ITS測序，得到了大小為571bp的序列。在NCBI 中檢索與該菌株序列相似性較高的菌株，結果表明ZX26菌株與GenBank數據庫中紅曲霉菌株同源性高達98%～99%。進化性分析表明(圖2)，紅曲霉ZX26與Monascuspurpureusstrain FRR 1596親緣關系最近，因此并將其命名為紫紅曲霉ZX26(MonascuspurpureusZX26)，且經中國科學院微生物研究所進行微生物菌種鑒定，此菌株為紫紅曲霉(Monascuspurpureus)，并于2018年07月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.15992。

圖1 菌株ZX26 形態學鑒定Fig.1 Morphological identification of strain ZX26

2.4 單因素培養條件確定

2.4.1 接種量的確定

不同接種量對紫紅曲霉ZX26的影響結果如圖3所示，接種量在體積分數7%～9%時，有利于Monacolin K產量增加，在體積分數為7%的接種量時Monacolin K產量最高，為101.62 mg/L。當接種量大于體積分數9%時，Monacolin K產量開始下降。分析由于隨著接種量的增加，菌體繁殖速度加快，Monacolin K的產量也相應增加，但當接種量過高，菌體需要的能量大于培養基能提供的能量時，由于營養物質匱乏導致紫紅曲霉ZX26生命活力下降，故Monacolin K的產量也相應減少。

2.4.2 發酵溫度的確定

不同發酵溫度對紫紅曲霉ZX26的影響結果如圖4所示，隨著發酵溫度的提高，Monacolin K產量增加，在30 ℃時Monacolin K產量達到最大值，為111.47 mg/L，隨后隨著溫度的升高，Monacolin K產量開始下降。分析由于菌體對溫度較為敏感，溫度過高或過低都會使Monacolin K產量降低。

圖2 基于菌株ZX26 的ITS 序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZX26 based on ITS sequences

圖3 不同接種量下Monacolin K的產量Fig.3 The effects of different inoculum on Monaeolin K production

圖4 不同發酵溫度對Monacolin K 產量的影響Fig.4 The effects of different temperature on Monaeolin K production

2.4.3 發酵時間對Monacolin K產量的影響

不同發酵時間對紫紅曲霉ZX26的影響結果如圖5所示，隨著發酵時間的增加，Monacolin K產量也隨之增加。在14 天時Monacolin K產量達到峰值為100.30 mg/L，但是,相對比10 天時，Monacolin K產量僅增加了0.63 mg/L，結合實際分析，故認為最佳生長時間為10天。推測是因為在發酵初期，培養基內的營養物質充裕，菌體大量繁殖，故Monacolin K產量增加。后期培養基內的營養物質減少，同時菌體處于衰亡期，菌體數量開始減少，故產生Monacolin K的產量也相應減少。

圖5 不同發酵時間對Monacolin K 產量的影響Fig.5 The effects of different fermentation time on Monaeolin K production

圖6 不同初始pH對Monacolin K產量的影響Fig.6 The effects of different potential of hydrogen on Monaeolin K production

2.4.4 初始pH對Monacolin K產量的影響

初始pH對紫紅曲霉ZX26的影響結果如圖6所示，Monacolin K產量在初始pH 4～6范圍內較為理想。當發酵液的初始pH為4.0時，Monacolin K產量達到峰值為87.5 mg/L。當發酵液pH大于5.0時，Monacolin K產量急劇下降。

2.5 正交試驗結果

為了更加方便快捷的確定各因素對Monacolin K產量的影響，以接種量、發酵溫度、發酵時間、初始pH值設計了單因素試驗并結合單因素試驗的結果，設計四因素三水平正交試驗L9(34)。試驗設計如表4，試驗結果如表5。

表4 不同元素水平

表5 發酵條件優化正交試驗結果與分析

結果所示，極差R值大小順序為：RB>RD>RA>RC，說明發酵溫度是Monacolin K產量最顯著的影響因素。K值分析結果顯示，4個因素的最優組合為A1B1C3D3，即接種量為體積分數7%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為10天，初始pH值為4.0。根據此組合進行發酵試驗驗證(設置3個平行組)，得出最終Monacolin K產量271.36 mg/L，高于正交試驗中所有的組合結果，說明該組合確實為最佳發酵條件。

3 結論

本文從高產Monacolin K的紅曲霉菌株篩選出發，獲得一株Monacolin K產量較高的紫紅曲霉ZX26菌株，并對培養條件進行進一步優化。獲得結論為，在培養基組分為葡萄糖70 g/L，牛肉膏15 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.5 g/L下其最優發酵條件為：接種量為體積分數7%，發酵溫度為30 ℃，初始pH值為4.0，發酵時間為10 天。在此條件下，紫紅曲霉ZX26發酵液中Monacolin K產量達271.36 mg/L，相對于培養條件優化前Monacolin K產量提高152.19%，經驗證此培養條件下Monacolin K產量最佳。通過實驗為紫紅曲中Monacolin K的進一步研究提供了理論基礎。