武俊紫,侯 偉,胡冬雄,趙 微,賈亞敏,和鳳軍,宋 波*,楊榆青*
1云南中醫藥大學基礎醫學院,昆明 650504;2太原理工大學水利科學與工程學院,太原 030024
近年來隨著人們生活方式和飲食結構的改變,糖尿病發生率逐年升高[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病最常見的微血管病變之一,不僅可造成腎損害,也可累及其他臟器,因此需積極關注。川陳皮素是中藥陳皮中有效活性藥理成分之一,其來源廣泛,具有廣譜抗菌、抗癌以及消炎等多種藥理活性[2]。目前關于川陳皮素對糖尿病腎病的研究還沒有文獻報道,但是陳皮提取物的研究已有文獻報道,如鐘志華等[3]采用金柚提取物(含有川陳皮素)治療糖尿病腎病大鼠,發現其對糖尿病腎病大鼠具有很好的保護作用,并分析其作用機理可能和p38 MAPK/NF-κB P65信號通路有關。此外,何偉等[4]采用橙皮苷(陳皮的另一種有效藥理成分)治療糖尿病腎病大鼠,也發現其對腎功能具有很好的保護作用?;谏鲜鐾茰y,川陳皮素可能對其也具有一定的保護作用,為此,本研究構建了糖尿病腎病大鼠模型,觀察川陳皮素的治療效果,為糖尿病腎病的治療和川陳皮素的開發提供參考。
1.1.1 實驗動物
雄性清潔級SD大鼠120只(6~7周齡),體重180±20 g,(動物許可證號:SCXK-(云) 2011-004),購于昆明醫科大學動物實驗中心,普通飼料和高脂飼料(許可證號:蘇飼證(2018)10030)購于昆明醫科大學動物實驗中心。大鼠購買后飼養于云南中醫藥大學動物實驗中心,飼養環境為溫度22~26 ℃,濕度40%~60%,光照/黑暗=12/12 h。
1.1.2 藥物、試劑和試劑盒
川陳皮素(陜西永健生物工程科技有限公司,批號:170719);貝那普利(北京諾華制藥有限公司,國藥準字H20030514); 鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ,美國Sigma公司,批號:170224);尿蛋白定量試劑盒、尿肌酐試劑盒、血肌酐試劑盒和血尿素氮測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為:170321、170324、170112和170402);胰島素、總膽固醇和甘油三脂試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司,批號分別為:170423、170312和170506);兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體以及兔抗大鼠單克隆抗體β-actin (美國Santa公司,批號分別為: C2342、C2351、C3104和C2019);生物素化山羊抗兔IgG抗體和DAB顯色試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司,批號ZB-2305);RNA引物(上海生物生工設計和生產,批號:171105);IL-1、IL-6和TNF-α測定試劑盒(武漢博士德生物科技公司,批號分別為:170614、170622和170524)。
1.1.3 主要實驗儀器
酶標儀(PT-3502,北京普天新橋技術有限公司);分光光度計(752N,上海精密科學儀器有限公司);血糖測定儀(安穩免調碼型,三諾生物傳感股份有限公司);光學顯微鏡(XSP-9CA,上海光學儀器廠);電熱鼓風干燥箱(101-0ab,上海徐吉電氣有限公司);低溫高速離心機(TG16-WS型,常州市萬合儀器制造有限公司);超低溫冰箱(DW-86L288,海爾集團);電子分析天平(HZK-110型,賽恩斯儀器設備有限公司);蛋白電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra,美國伯樂);實時熒光定量PCR儀(StepOne TM,美國應用生物系統公司)。
1.2.1 模型構建
大鼠在購買后先給予適應性喂養2周,2周后隨機選取20只作為正常組,其余100只給予高脂高糖飼料喂養1月,之后給予腹腔一次性注射STZ 30 mg/kg造模,STZ注射1周后檢驗造模是否成功,糖尿病造模成功標準參照文獻[5]進行。
1.2.2 分組及給藥
造模成功后,隨機選取50只按照隨機數字法分為:(1)模型對照組(生理鹽水1 mL/kg灌胃);(2)川陳皮素低劑量組(100 mg/mL/kg/天 川陳皮素灌胃);(3)川陳皮素中劑量組(200 mg/mL/kg/天 川陳皮素灌胃);(4)川陳皮素高劑量組(400 mg/mL/kg/天 川陳皮素灌胃);(5)貝那普利組(4 mg/mL/kg/天 貝那普利灌胃),另挑選正常大鼠10只作為正常組(生理鹽水1 mL/kg灌胃),連續給藥6周,(川陳皮素給藥劑量根據文獻確定[6])6周后處死大鼠,處死前一天大鼠置入代謝籠收集尿液,次日10%水合氯醛 0.3 mL/100 g麻醉后固定于解剖板,腹主動脈取血;血液收集后剖取腎臟,檢測下述相關指標的變化特點。
1.3.1 一般情況
實驗期間記錄大鼠一般情況,包括飲食狀態、大小便特點、毛色、精神活動量以及死亡情況等。
1.3.2 血糖和胰島素
血糖的測定采用血糖儀測定,胰島素的測定采用胰島素試劑盒,胰島素測定的檢測儀器為分光光度計。
1.3.3 24小時蛋白尿定量和尿液以及腎功能指標
24 h尿蛋白定量、尿肌酐、血肌酐和血尿素氮測定采用相應試劑盒進行,檢測儀器為分光光度計。
1.3.4 炎性因子指標
炎性因子指標的測定采用對應試劑盒進行,檢測儀器酶標儀。
1.3.5 血脂指標
總膽固醇和甘油三脂的測定方法為Elisa法,檢測儀器為酶標儀。
1.3.6 組織病理學
組織病理學檢測采用HE 染色法:中性福爾馬林溶液固定48 h后,切取一小塊用石蠟包埋,切成3~5 μm左右薄片,之后脫蠟沖洗,蘇木精和伊紅依次染色,封固,完成后照相采集圖片,每張片隨機選取4個不同的視野。
1.3.7 蛋白表達
稱取100 mg腎臟組織用組織裂解液裂解后,4 ℃ 12 000 rpm離心10 min,后收集上清用BCA法對蛋白進行定量并調平。調平后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳,完成后將目的蛋白轉移到PVDF膜,加入脫脂牛奶封閉2 h,后加入1抗過夜,次日取出加入2抗1 h,洗滌三次后暗室曝光洗片掃描儀掃描收集圖像即可。
表1 引物序列設計表
1.3.8 mRNA表達
用天根總RNA試劑盒提取各組大鼠總RNA后定量并調平,然后將其逆轉錄為cDNA,逆轉錄完成后,每組取2 μg行實時熒光定量PCR擴增反應,擴增條件:95 ℃ 2 min、94 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 40 s,循環次數36次。分析方法選用2-ΔΔCt法,引物序列如下表1所示:
正常組大鼠毛色發白發亮,精神活躍、飲食、大小便均正常。模型組毛色發黃灰暗、精神相對萎靡、尿液量多且明顯發臭。相較于模型組,貝那普利組和川陳皮素三個劑量組有明顯改善。在整個治療期間,正常組、模型組、貝那普利組、川陳皮素低、中和高劑量組分別死亡0、2、1、1、0、1 只。
在整個治療期間,與正常組相比,模型組、貝那普利組、川陳皮素低、中和高劑量組體重均明顯降低(P<0.05),治療0周時模型組和貝那普利組、川陳皮素低、中和高劑量組沒有差異。治療2周后,貝那普利組和川陳皮素高劑量組明顯高于模型組(P<0.05),治療4周和6周后,貝那普利組、川陳皮素中劑量和高劑量組明顯高于模型組(P<0.05),詳見表2。
表2 藥物治療后大鼠體重變化
注:表2和表4,與正常組相比,*P< 0.05;與模型組相比,#P< 0.05。
Note:Table 2 and Table 4,compared with normal group,*P< 0.05;compared with model group,#P< 0.05.
腎臟組織病理學結果可見,正常組切片腎小球正常,沒有明顯病理損害特征,而模型組則出現明顯腎小球增大,同時可見有部分的系膜增生和間質纖維化(圖中箭頭處為腎小球增大,同時系膜增生位置),貝那普利組和川陳皮素三個劑量組相較于模型組腎小球病變減輕,系膜增生和間質纖維化也沒有模型組嚴重,詳見圖1。
圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結果(×400)Fig.1 HE staining results of kidney tissues (×400)注:圖中A、B、C、D、E和F分別為正常組、模型組、貝那普利組以及川陳皮素低、中和高劑量組。Note:A,B,C,D,E and F are the normal group,the model group,the benazepril group and the low,medium and high dose nobiletin group in the figure.
各組大鼠尿肌酐(Urine Creatinine,UCr)和24 h蛋白尿定量比較,與正常組相比,模型組二者均明顯升高(P<0.05),與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中、高劑量組二者均明顯降低(P<0.05),此外川陳皮素高劑量組24 h蛋白尿定量明顯低于貝那普利組(P<0.05),UCr則沒有統計學差異(P>0.05),詳見表3。
表3 各組大鼠尿肌酐(UCr)和24h蛋白尿定量比較
注:表3、表5、表6、表7、表8和表9,與正常組相比,*P< 0.05;與模型組相比,#P< 0.05;與貝那普利組相比,^P< 0.05。
Note:Table 3,Table 5,Table 6,Table 7,Table 8 and Table 9,compared with normal group,*P< 0.05;compared with model group,#P< 0.05;compared with benazepril group,^P< 0.05.
各組大鼠腎功能指標血清肌酐(serum creatinine,Scr)和血清尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)比較,與正常組相比,模型組BUN和Scr均明顯升高(P<0.05);與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中和高劑量組BUN和Scr均明顯降低(P<0.05);此外川陳皮素三個劑量組和貝那普利組相比并沒有差異(P>0.05),詳見表4。
各組大鼠血糖和胰島素比較,與正常組相比,模型組血糖明顯升高(P<0.05),胰島素明顯降低(P<0.05);與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中和高劑量組血糖降低(P<0.05),胰島素水平升高(P<0.05);此外川陳皮素三個劑量組血糖明顯低于貝那普利組(P<0.05),胰島素明顯高于貝那普利組(P<0.05),詳見表5。
表4 各組大鼠腎功能指標BUN和Scr比較
表5 各組大鼠血糖和胰島素水平比較
各組大鼠血脂指標總膽固醇(Total Cholesterol,TC)與甘油三酯(Triglyceride,TG)比較,與正常組相比,模型組TG和TC均明顯升高(P<0.05);與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中和高劑量組TG和TC均明顯降低(P<0.05);此外川陳皮素三個劑量組TG和TC明顯低于貝那普利組(P<0.05),詳見表6。
表6 各組大鼠血脂指標TG和TC比較
各組大鼠血清炎性因子指標白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)比較,與正常組相比,模型組上述三個指標均明顯升高(P<0.05);與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中和高劑量組均明顯降低(P<0.05);此外川陳皮素高劑量組明顯低于貝那普利組(P<0.05),詳見表7。
表7 各組大鼠炎性因子比較
各組大鼠腎臟組織中B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)的蛋白質和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)蛋白及mRNA表達量比較,與正常組相比,模型組Bax和Caspase-3明顯升高(P<0.05),Bcl-2明顯降低(P<0.05);與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中、高劑量組Bax和Caspase-3 明顯降低(P<0.05),Bcl-2 明顯升高(P<0.05);此外川陳皮素三個劑量組Bax和Caspase-3明顯低于貝那普利組(P<0.05),川陳皮素中劑量和高劑量組Bcl-2明顯高于貝那普利組(P<0.05),詳見圖2、表8和表9。
圖2 大鼠腎臟組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達圖Fig.2 The protein expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 注:圖中A、B、C、D、E和F分別為正常組、模型組、貝那普利組以及川陳皮素低、中和高劑量組。Note:A,B,C,D,E and F are the normal group,the model group,the benazepril group and the low,medium and high dose nobiletin group in the figure.
表8 各組大鼠腎臟組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的相對表達量
表9 各組大鼠腎臟組織中凋亡相關Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA表達結果
基于傳統中藥學理論,采用現代化技術手段開發低毒和高效作用的中藥單體對糖尿病腎病的治療和我國中醫藥的發展具有重要的意義[7-9]。正如前言推測,川陳皮素對糖尿病腎病具有一定的保護作用,但作用機理未明。為此本研究構建了糖尿病腎病大鼠模型,從細胞凋亡途徑觀察川陳皮素對其的作用。結果從尿液腎功能指標和血液腎功能指標BUN、Scr、UCr 和24 h尿蛋白定量可看出,相較于正常組,模型組均BUN、Scr、UCr 和24 h尿蛋白定量均明顯升高,這證明糖尿病腎病大鼠模型成功構建。采用川陳皮素治療后,大鼠BUN、Scr、UCr 和24 h尿蛋白定量均降低,這證明了川陳皮素對糖尿病腎病具有調節作用。
關于DN的發病機制,目前的研究認為高血糖可能是其最直接的因素[10]。腎臟在長期高血糖的浸潤下,可引起炎性細胞過量分泌,而炎性細胞可激活核因子、絲裂元活化蛋白激酶家族等多種炎性通路,誘發IL-1、IL-6和TNF-α等分泌[11-13]。本次研究發現,與模型組相比,貝那普利和川陳皮素均可有效降低血糖和炎性因子指標IL-1、IL-6和TNF-α,同時還可升高血清胰島素含量,這提示川陳皮素對降低血糖、降低炎癥反應和升高胰島素方面具有明顯優勢。此外有文獻報道[14]約有25%血糖控制良好的患者仍會發生DN,這提示高血糖并不是糖尿病腎病發生的唯一原因,可能存在其他因素造成糖尿病腎病的發生,其中高血脂可能是造成DN發生的關鍵。有研究顯示,在對炎癥因子的刺激方面,高血脂和高血糖具有相似性,高血脂也會造成炎性細胞在腎臟聚集,進而導致IL-1、IL-6和TNF-α等炎性因子的釋放[15],為此本次研究考查了川陳皮素治療后血脂TG和TC的變化特點,研究結果發現,與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中、高劑量組血清中TG和TC均明顯降低,這提示川陳皮素對糖尿病腎病血脂具有明顯的調控作用。在研究中同時發現貝那普利也可以降低血糖同時調節血脂,這與文獻報道[16,17]有一定差異,分析原因可能是由于本研究中給予大鼠貝那普利灌胃,大鼠進食量有一定減少造成的,也可能是貝那普利有明顯保護腎臟的作用,腎功能改善后,大鼠精神活動有明顯增加,運動量的增加對糖尿病血糖降低是有一定作用的,但具體原因仍需要后續進一步研究證實。
除上述機制外,腎臟細胞凋亡也在糖尿病腎病的發生和發展中伴有重要作用[18,19]。腎臟細胞在凋亡初始就參與了糖尿病腎病的各個環節。在腎臟凋亡的發生過程中,Bcl-2蛋白家族在其中占有十分重要的地位, Bcl-2蛋白家族中Bcl-2/Bax的比值決定著細胞凋亡的走向,當Bcl-2/Bax比值上調時,可以抑制細胞凋亡;當Bcl-2/Bax比值下調時,則促進細胞凋亡[18]。除Bcl-2家族蛋白,Caspase-3蛋白也與糖尿病腎病腎臟凋亡密切相關[20,21]。因此本次研究觀察了川陳皮素對上述三個蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的影響,結果發現,與模型組相比,貝那普利組和川陳皮素低、中和高劑量組Bax和Caspase-3 明顯降低,Bcl-2 明顯升高,這提示川陳皮素在抗糖尿病腎病大鼠腎臟組織凋亡方面具有明顯的優勢,通過改善凋亡,進而保護腎臟組織。
綜合提示,川陳皮素對對糖尿病腎病大鼠血液腎功能和尿液腎功能具有很好的改善作用,其作用機理可能與川陳皮素可降低血糖、升高胰島素,同時調節血脂TG和TC,以及通過調控Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白和mRNA表達,進而抑制細胞凋亡有關。