胰蛋白酶消化法測定牛膠原蛋白三股螺旋結構的含量

梁健華，梁 杏，李奕恒

廣州創爾生物技術股份有限公司，廣州 510000

膠原蛋白是脊椎動物細胞外基質中的一個重要組成部分，是哺乳動物中最豐富的蛋白質，約占總蛋白質量分數的20%～30%。由于膠原蛋白具有顯著的成纖維結構，良好的生物降解性，優越的生物相容性及較低的抗原性等優點，其已經廣泛運用生物醫學領域上。天然的膠原蛋白分子由三部分組成：非螺旋氨基末端部分，中心三股螺旋部分和非螺旋羧基末端部分。三股螺旋結構部分是由約為300個重復的“Gly-X-Y”單元組成，其中X通常是脯氨酸(Pro)，Y通常是羥脯氨酸(Hyp)，該重復單元約占總肽鏈長度的95%以上。膠原蛋白的三股螺旋結構，能使細胞吸附、遷移于膠原蛋白基上，甚至能調節和促進細胞的分化，并有助于維持組織和器官的穩定性和完整性?？梢?，三股螺旋結構是膠原蛋白生物活性的一個重要標志，是其發揮功能特性的前提[1]。此外，膠原蛋白的三股螺旋結構決定了其物理、化學性能，是膠原蛋白應用于各領域的重要前提，例如利用具有三股螺旋結構膠原蛋白的成纖維能力制備的膠原蛋白海綿，可用于體內止血[2]。然而，天然的膠原蛋白的三股螺旋結構容易受加工環境的影響[3]，在膠原蛋白的生產加工中不可避免會引入物理熱[4]、輻照[5,6]、剪切、酸及其他化學試劑[7,8]等，這會對膠原蛋白的三股螺旋結構造成破壞甚至完全破壞，導致其失去天然的生物活性功能，最終影響產品的質量。

目前，膠原蛋白三股螺旋結構的檢測方法主要為圓二色譜法(CD)[9]和紅外光譜法(FTIR)[10]。然而，這兩種方法都只能定性的判斷膠原蛋白中三螺旋結構的破壞程度，卻無法定量檢測三股螺旋結構的含量。通常通過測定膠原蛋白中Hyp的含量可以間接地測定膠原蛋白的含量[11,12]。設想在測定Hyp含量前，是否可通過預處理分離膠原蛋白中三股螺旋結構完整的膠原蛋白和三股螺旋結構破壞的膠原蛋白，從而實現完整三股螺旋結構膠原蛋白含量的測定。

本研究依據上述設想，利用完整三股螺旋結構的膠原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋結構完全破壞或部分破壞的膠原蛋白則能被胰蛋白酶酶解的原理[13]，通過摸索膠原蛋白或明膠與多肽的分離條件、利用三螺旋結構破壞的明膠液為底物摸索胰蛋白酶酶解條件，建立適用于含膠原蛋白的溶液體系中三股螺旋結構質量分數檢測的方法，以彌補現今檢測方法的不足，為膠原蛋白基產品的質量評估提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

片狀的去筋膜及除雜蛋白/脂肪后的牛筋由廣州創爾生物技術股份有限公司提供；牛I型膠原蛋白標準品和L-羥脯氨酸(純度≥98.0%，分子量為131.13 g/mol)購自Sigma；胃蛋白酶(比活力1∶10 000)和胰蛋白酶(酶活力為3 000 U/mg，)購自阿拉??；α-氨基丁酸(AABA，純度>98.0%，分子量為103.12 g/mol)購自麥克林；Waters AccQ·Fluor試劑盒(包含硼酸緩沖液(Buffer 1)，衍生劑粉末(6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯，2A)，衍生劑稀釋液(2B)，Eluent A緩沖溶液)和氨基酸水解標樣(含17種水解氨基酸各2.5 mmol/L(僅胱氨酸為1.25 mmol/L，不含羥脯氨酸))購自Waters；其它用于液相色譜分析的化學試劑為色譜級，其余為分析純。

1.2 樣品液制備

1.2.1 牛筋膠原蛋白的制備

膠原蛋白的提取參考文獻的方法[14]，描述如下：往粉碎后的牛筋中加入濃度為0.5 M的醋酸溶液(1∶50(w/v)，含0.3%的胃蛋白酶(w/w))攪拌提取。提取后的蛋白液在4 ℃下離心(10 000 rpm，30 min)得到上清膠原蛋白液，置于4 ℃下透析處理48 h，用于后續膠原蛋白三股螺旋結構的分析。

1.2.2 明膠液的制備

明膠液的制備參考文獻[13]。取上述膠原蛋白液于60 ℃下處理10 min，恢復至常溫后，作為胰蛋白酶酶解條件摸索的底物。

1.3 儀器與設備

5804R高速冷凍離心機，德國eppendorf公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器公司；Waters Alliance e2695-2489，配Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱，美國Waters公司；Chirascan圓二色譜儀，英國Applied Photophysics公司；DSC 214 差式掃描量熱儀，德國NETZSCH公司；Vertex 70紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.4 方法

1.4.1 膠原蛋白三股螺旋結構質量分數測定方法的建立

1.4.1.1 TCA沉淀膠原蛋白/明膠條件的單因素試驗

TCA能沉淀蛋白溶液體系中的蛋白質，本試驗考察了TCA的質量分數和離心轉速兩個因素分別對膠原蛋白、明膠沉淀效果的影響，以蛋白質的沉淀率為評價指標。

(1)TCA質量濃度的確定

分別取一定質量的膠原蛋白液和明膠液，各加入相同體積的4 ℃的TCA溶液，以保證TCA溶液的終質量分數分別為0%、5%、10%和15%?；靹蚝?，置于5 000 rpm下離心10 min。取上清液，根據Lowry法測定上清液的蛋白濃度。蛋白質的沉淀率以S(%)表示，結果按下式(1)計算，實驗平行測定3次。

(1)

式中：S為蛋白的沉淀率，單位為%；Cx%TCA為當TCA為5%，10%和15%時，上清液蛋白質的濃度，單位為mg/mL；C0%TCA為當TCA為0%時蛋白質的濃度，單位為mg/mL。

(2)沉淀離心轉速的確定

根據1.4.1.1的結果，分別取一定質量的膠原蛋白液和明膠液，各加入相同體積的4 ℃的TCA溶液，以保證TCA的終質量分數為10%?；靹蚝?，分別置于1 000、5 000、8 000 rpm下離心10 min。取上清液，使用Lowry法測定上清液的蛋白質的質量濃度。蛋白質的沉淀率以S(%)表示，結果按下式(2)計算，實驗平行測定3次。

(2)

式中：S為蛋白質的沉淀率，單位為%；CCrs為當離心轉速為1 000、5 000、8 000 rpm時，上清液蛋白質的質量濃度，單位為mg/mL；C0%TCA為當TCA為0%時蛋白質的質量濃度，單位為mg/mL。

1.4.1.2 胰蛋白酶酶解條件的摸索試驗

1.4.1.2.1 酶酶前的處理

用0.5 M NaOH溶液或者醋酸溶液調節明膠液(200 mL，4 mg/mL)pH為3.6～3.7，加入10 mL胰蛋白酶液(1 mM HCl含0.05 mol/L CaCl2溶液溶解)，得到待酶解體系液；取待酶解體系液(m)，加入鹽酸溶液，水解后，使用柱前衍生-高效液相色譜法測定水解液中Hyp的質量濃度，得到酶解前待酶解體系液中Hyp的質量濃度。

1.4.1.2.2 酶解

將待酶解體系液置于恒溫振蕩條件下進行酶解反應；分別對酶解時間(0～48 h)[15]、酶與底物比例(根據阿拉丁試劑的推薦配置比例選取1∶20、1∶50和1∶100 )和酶解溫度(20、25、30 ℃)這三個因素進行探索。

1.4.1.2.3 酶解后的處理

取酶解后溶液(m)，加入質量比為1∶0.5的4 ℃的30%的TCA溶液，以保證TCA溶液的終質量濃度為10%，混勻后，在4 ℃，5 000 rpm離心10 min。棄去上清液，用4 ℃的5%TCA溶液清洗沉淀表面3次后，加入鹽酸溶液，水解，同上方法測定沉淀樣品中Hyp的質量濃度，得到酶解后沉淀樣品中Hyp的質量濃度。

1.4.1.2.4 降解率的計算

明膠的降解率以Hyp的剩余率表示，明膠的降解率按式(3)計算：

(3)

式中：Y為明膠的降解率，單位為%；X1為酶解前待酶解體系液中Hyp的質量濃度，單位為mg/g，X2為酶解后沉淀樣品中Hyp的質量濃度，單位為mg/g。

特別的，由于牛筋膠原蛋白的熱變性溫度約為41 ℃[16]，對熱較為敏感，因此有必要對酶解的溫度進行探索。試驗如下：分別取膠原蛋白液和明膠液，加入胰蛋白酶液后，置于25、30、37 ℃恒溫振蕩酶解反應，結合蛋白電泳(SDS-PAGE)方法對酶解前后膠原蛋白和明膠進行分析。

1.4.1.3 柱前衍生-高效液相色譜法測定Hyp的質量濃度

1.4.1.3.1 Hyp的衍生處理

Hyp的衍生及內標AABA的使用參照Waters衍生試劑盒說明書。

1.4.1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters AccQ·TagTM (3.9×150 mm)；柱溫：37 ℃；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min。流動相梯度如下表1所示。使用內標法計算Hyp的含量，Hyp及AABA的液相色譜圖如圖1所示。

表1 梯度洗脫條件

圖1 十八種氨基酸及AABA的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatography of 18 amino acids and AABA

1.4.2 膠原蛋白溶液體系中三股螺旋結構質量分數的測定

使用上述1.4.1所建立的方法，對明膠膠原混合液、不同提取批次的膠原蛋白液，和不同純化處理后的膠原蛋白液這三種樣品(三種樣品的制備如下表2所示)中的三股螺旋結構進行檢測。此外，為了驗證所建立的方法與現用方法的差異，使用CD法[17]和FTIR法[18]分別對不同提取批次(A、B和C)的膠原蛋白液的結構進行測定，獲得膠原蛋白的二級結構特征吸收峰數據，與所建立的方法進行對比。

膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數按式(4)計算：

(4)

式中：NC為樣品中膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數，單位為%；X1為酶解前待酶解體系液中Hyp的質量濃度，X2為酶解后沉淀樣品中Hyp的質量濃度，單位為mg/g。

表2 不同提取時間膠原蛋白中羥脯氨酸的質量濃度

1.5 數據分析

每個樣品設3個平行，采用Origin 8.0和SPSS 19軟件進行數據分析，采用Tukey法對不同樣品平均值進行方差分析，求出顯著性差異，方差分析置信度為95%。

2 結果與討論

2.1 膠原蛋白三螺旋結構質量分數測定的方法建立

2.1.1 TCA質量分數、離心轉速對蛋白質沉淀率的影響

圖1是不同的TCA質量分數和離心轉速時明膠和膠原蛋白沉淀率的變化圖。TCA是一種良好的沉淀劑，能分離溶液中的大分子蛋白和多肽及氨基酸。在TCA溶液體系中，蛋白質分子相互聚集而沉淀，溶解度表現最小[19]。從圖2可知，隨著TCA質量分數的增大，明膠或膠原蛋白的沉淀率均增大并最終達到最大——當TCA的質量分數為5%時，明膠的沉淀率為39.04%；當TCA濃度為10%和15%時，明膠的沉淀率分別為69.49%和70.22%，兩者沒有顯著性差異。當TCA的質量分數為5%時，膠原蛋白的沉淀率為37.58%；而當TCA濃度為10%和15%時，膠原蛋白的沉淀率分別為89.74%和91.48%，兩者沒有顯著性差異。隨著離心轉速的增大，明膠或膠原蛋白的沉淀率也呈現相似的規律，當離心轉速為5 000 rpm時，明膠和膠原蛋白的沉淀率分別為70.22%和91.34%，兩者均與離心轉速為8 000 rpm時蛋白質的沉淀率無顯著性差異。此外，對比相同的沉淀條件(如相同的TCA質量分數或離心轉速)，明膠的沉淀率較膠原蛋白的沉淀率低，這是因為，明膠中的分子量較小的多肽不能被TCA沉淀而保留在上清液。綜合圖2可得到，質量分數為10%的TCA溶液，在5 000 rpm離心轉速下，足以將溶液中的蛋白質和分子量較小的多肽分離。

圖2 TCA的質量分數(A)和離心轉速(B)對明膠和膠原蛋白沉淀率的影響Fig.2 Effects of mass fraction of TCA (A) and centrifugal speed (B) on the yield of gelatin and collagen sediment注：不同小寫字母a-b表示明膠的蛋白沉淀率在不同TCA質量分數或不同離心轉速處理后，具有顯著性差異(P<0.05,n=3)；不同大寫字母A-B表示膠原蛋白的蛋白沉淀率在不同TCA質量分數或不同離心轉速處理后，具有顯著性差異(P<0.05,n=3)。Note∶Different lower-case letters a-b means gelatin treated by different mass fraction of TCA or centrifugal speed indicated significant difference (P<0.05,n=3);Different uper-case letters A-B means gelatin treated by different mass fraction of TCA or centrifugal speed indicated significant difference (P<0.05,n=3).

2.1.2 胰蛋白酶酶解條件對明膠降解率的影響

2.1.2.1 酶解時間和酶與底物比例對明膠降解率的影響

胰蛋白酶能酶解三螺旋結構被破壞的膠原蛋白，能穩定的作用于明膠分子鏈中的賴氨酸和精氨酸，使明膠酶解為多肽或者氨基酸[20]。以明膠作為胰蛋白酶酶解底物評價不同酶用量對明膠酶解反應體系的影響，如圖3所示。圖3-A是當胰蛋白酶與明膠的比例為1∶50、酶解溫度為25 ℃時不同酶解時間的明膠降解率，隨著酶解時間的延長，明膠的降解率呈先緩慢增加到最大再維持不變的趨勢，且當酶解時間為3 h時，明膠的降解率達到最大，約為91.61%。圖3-B是不同酶與底物的比例對明膠的降解率的影響。由圖可知，當酶的用量為1∶20時，隨著酶解時間的延長(0.5～6 h)，明膠的降解率維持在82%到88%之間，提高酶的用量(從1∶50到1∶20)有利于酶解反應的進行。當酶與底物的比例為1∶100時，相同時間的降解率相對標準偏差較大(如當酶解時間為4和5 h時，明膠降解率的相對標準偏差分別為12.98%和10.38%)，且明膠的降解率變化趨勢不規律。這可能是因為當胰蛋白酶的用量較少時，酶解反應體系會不穩定。綜合圖3可得，當胰蛋白酶與底物為1∶50時，3 h能將明膠體系完全降解。

圖3 酶解時間(A)和酶與底物的比例(B)對明膠降解率的影響Fig.3 Effects of incubation time (A) and enzyme/substrate ratio (B) on the degradation rate of gelatin

2.1.2.2 酶解溫度對明膠降解率的影響

膠原蛋白具有熱不穩定性的特征，酶解溫度的確定是該方法建立的關鍵影響因素之一。圖4是酶解溫度分別為20、25、30 ℃時明膠的降解率圖。如圖所示，當酶解溫度為20 ℃時，明膠的降解率逐漸增大，直至5 h才達到最大，約為92.68%；而當酶解溫度為30 ℃時，在1～6 h內，明膠的降解率由70.17%逐漸增大至99.67%，這可能是因為在30 ℃時，隨著酶解時間的增加，明膠液中未破壞的三股螺旋結構也遭到一定程度的破壞；但當酶溫度為25 ℃時，明膠的降解率在3 h內達到最大，約為91.61%。從不同酶解溫度處理的明膠和膠原蛋白電泳圖(圖5)中也發現，在25 ℃和30 ℃時(圖5-A和圖5-C)，膠原蛋白的α、β條帶的顏色深度和位置均未有明顯的變化；而明膠在25 ℃酶解時(圖5-B)，隨著酶解時間的延長，分子量較大的α鏈條帶其以下的條帶逐漸消失；這表明30 ℃及其以下的溫度，酶解后膠原蛋白的三股螺旋結構不會發生改變；而在30 ℃酶解時，明膠中部分的完整的三股螺旋結構會遭到破壞。從圖5-D發現，當酶解溫度為37 ℃時，隨著酶解時間的延長，膠原蛋白的α、β鏈條帶的顏色逐漸變淺，這是因為在37 ℃酶解時，膠原蛋白的完整三股螺旋結構遭到破壞，致使胰蛋白酶作用三股螺旋結構破壞的膠原蛋白。綜上所述，一方面，37 ℃及其以上的溫度會使膠原蛋白的三螺旋結構破壞，而30 ℃會破壞明膠中存在的三股螺旋結構；另一方面，較低的溫度(如20 ℃及其以下的溫度)，酶解反應的速率會較慢。因此，選擇25 ℃為該方法的最適酶解溫度。綜合2.1.2所述，為了保證膠原蛋白體系酶解反應的完全，胰蛋白酶酶解反應體系的最適條件為25 ℃，胰蛋白酶與底物的比例為1∶50時，酶解3 h即可將膠原蛋白溶液體系中三股螺旋結構破壞的成分酶解完全。

2.2 膠原蛋白溶液體系中三股螺旋結構質量分數的測定

2.2.1 明膠膠原混合體系中膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數測定

明膠是膠原蛋白三螺旋結構破壞后的產物，使用所建立的方法測定明膠膠原的混合體系中三螺旋結構的質量分數，以表征該方法對復雜的含膠原蛋白三股螺旋結構的溶液體系的適應性。如表3所示，當明膠膠原混合體系中膠原蛋白的質量分數為80%、50%、40%、20%和0%時，使用所建立的方法測得的混合液中三股螺旋結構的膠原蛋白質量分數分別為76.97%、50.03%、33.67%、12.38%和3.84%；測定的不同質量分數梯度的膠原蛋白的混合液，均具有顯著性差異。從測定結果發現，當膠原蛋白的百分含量分別為80%、40%和20%時，所測得的結果較理論值小，而當膠原的百分含量為50%和0%時，所測得的結果較理論值大，這可能是因為膠原蛋白的三股螺旋結構在提取過程中有所破壞，導致在混合體系中測出的結果出現偏差。綜上所得，使用所建立的方法能較準確的得到不同比例的明膠膠原混合體系中三股螺旋結構的質量分數。

圖4 不同酶解溫度(20、25和30 ℃)下明膠的降解率酶解Fig.4 Degradation rate of gelatin incubated at different temperature (20,25 and 30 ℃)

圖5 不同酶解溫度(25、30和37 ℃)酶解處理(0～24 h)后膠原蛋白的電泳圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of proteins incubated in enzymatic treatment (0-24 h) at 25,30 and 37 ℃

2.2.2 不同提取批次的膠原蛋白中三股螺旋結構的質量分數測定

使用所建立的方法對相同方法不同提取批次的牛膠原蛋白液中的三股螺旋結構的質量分數進行測定(如表4所示)發現，提取批次A、B和C的膠原蛋白中三股螺旋結構的質量分數分別為89.48%、83.36%和85.37%，三股螺旋結構的含量均高于80%。而使用CD和FTIR法測定這三個提取批次膠原蛋白的結構發現：如圖6-A所示，膠原蛋白在198 nm處有一負吸收，在222 nm處有一正吸收，符合膠原蛋白的典型吸收波長，說明膠原蛋白液的三股螺旋結構較完整；從圖6-B膠原蛋白FTIR圖可知，膠原的酰胺II鍵(1 638 cm-1)及酰胺III鍵(1 239 cm-1)的吸收均符合膠原蛋白完整二級結構的特征吸收，說明膠原蛋白的三股螺旋結構相對完整。這與本方法所獲得的結果較吻合。但CD和FTIR的方法均無法定量膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數，而本方法能定量的判斷其三股螺旋結構的質量分數，彌補了現有定性檢測方法的不足。

明膠膠原混合液Mixture of gelatin and collagen solution三股螺旋結構的質量分數Content of triple helix conformation (%)20%G+80%C76.79±1.94a50%G+50%C50.03±3.07b60%G+40%C33.67±5.08c80%G+20%C12.38±0.19d100%G+0%C3.84±0.78e

注：C為膠原蛋白溶液；G明膠液；數值后面不同的字母表示數值間有顯著性差異(P<0.05)。

Note:C refered to collagen solutions;Grefered to gelatin solutions；values followed by different letters are significantly different (P<0.05).

提取批次Extraction batch三股螺旋結構的質量分數Content of triple helix conformation (%)A89.48±0.68aB83.36±1.98bC85.37±1.11b

注：數值后面不同的字母表示數值間有顯著性差異(P<0.05)。

Note:Values followed by different letters are significantly different (P<0.05).

圖6 膠原蛋白的圓二吸收光譜圖(A)和紅外吸收光譜圖(B)Fig.6 CD(A)and FTIR(B)spectra of collagen

2.2.3 不同純化處理的膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數測定

目前，膠原蛋白提取后的純化處理通常采用超濾和透析這兩種方法，使用本研究所建立的方法測定不同純化處理對膠原蛋白三股螺旋結構的影響可用于篩選合適的純化處理方式。表5是三種純化處理方式后膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數。如表5所示，經過超濾處理1后，膠原蛋白的三螺旋結構質量分數約為48.60%，遠低于超濾處理2的處理(97.80%)和透析處理(95.18%)，這表明超濾處理1該純化處理會使膠原蛋白中部分三螺旋結構破壞。除此之外，該方法還可用于膠原蛋白生產制備時工藝的評價(該部分數據未列出)。因此研究所建立的方法可用于輔助測定膠原蛋白加工處理后三股螺旋結構變化，從而選擇合適的處理方法。

純化方式Purification treatment三股螺旋結構的質量分數Content of triple helix conformation (%)超濾處理1Ultrafiltration treatment 148.60±0.56a超濾處理2Ultrafiltration treatment 297.80±9.86b透析處理Dialysis treatment95.18±8.98b

注：數值后面不同的字母表示數值間有顯著性差異(P<0.05)。

Note:Values followed by different letters are significantly different (P<0.05).

本研究利用具有完整三股螺旋結構的膠原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋結構破壞或部分破壞的膠原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，建立膠原蛋白三股螺旋結構的檢測方法。如圖7所示，加入胰蛋白酶酶解膠原溶液體系，通過TCA沉淀分離酶解后體系中的膠原蛋白和多肽，測定酶解前后體系中膠原蛋白的特征氨基酸——Hyp的質量濃度變化，從而得到膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數。

圖7 利用胰蛋白酶酶解法檢測膠原蛋白三股螺旋結構示意圖Fig.7 Schematic illustration of determination triple helix conformation of collagen through trypsin digestion

3 結論

三股螺旋結構是膠原蛋白生物活性的一個重要標志，是其發揮功能特性的前提。在生物醫學、生物醫藥、生物工程等領域中通常需要對膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數進行測定?，F今膠原蛋白三股螺旋結構的檢測一般使用光譜法，這些方法只能定性的檢測三股螺旋結構是否破壞。而本研究利用完整螺旋結構的膠原蛋白對胰蛋白酶的耐受性建立了膠原蛋白三股螺旋結構質量分數的定量檢測方法。一方面，利用胰蛋白酶(胰蛋白酶/底物=1∶50)在25 ℃下，酶解處理3 h，使三股螺旋結構破壞的膠原蛋白酶解為分子量較小的多肽，另一方面，使用質量分數為10%的TCA溶液分離酶解后的小分子多肽及含有完整螺旋結構的膠原蛋白。通過使用柱前衍生高效液相色譜法測定酶解前后膠原蛋白復雜體系中羥脯氨酸的含量，從而獲得膠原蛋白三股螺旋結構的質量分數。該方法可有效應用于膠原蛋白制備、加工及膠原蛋白產品等含膠原蛋白復雜體系中三股螺旋結構含量的測定。