寧夏密點麻蜥不同部位含藥大鼠血清對人胃癌細胞凋亡的影響研究

李衛強，王 驕，關 芳，艾夢環

1寧夏醫科大學中醫學院；2寧夏醫科大學回醫藥現代化教育部重點實驗室，銀川750004

胃癌是一個多基因、多階段、多因素參與的病理過程，多數學者認為腸型胃癌發生遵循從慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌這一過程[1]。從正常胃黏膜到胃癌的發展過程中，細胞凋亡漸受抑制，細胞惡性增生逐漸顯現。因此，胃黏膜細胞凋亡較少是胃癌發生的重要機制，而如何促進細胞凋亡、抑制增殖是阻斷腫瘤發生的關鍵環節。我們采用寧夏密點麻蜥為主的復方蜥蜴散治療慢性萎縮性胃炎、胃癌前病變及胃癌，均取得較好的臨床療效。同時，前期通過復方蜥蜴散及單味寧夏密點麻蜥干預胃癌細胞的體外實驗研究也表明，該方及單味密點麻蜥可改善胃黏膜細胞缺血缺氧的微環境，促進細胞凋亡，阻斷癌變[2-8]。本實驗即在以上研究的基礎上，進一步研究寧夏密點麻蜥不同部位對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響及其機制，以期為深入探究密點麻蜥抗癌物質基礎提供科學依據。

1 材料

1.1 動物和試劑

4～6周齡雄性SD大鼠120只，SPF級，體重150～180 g，合格證號SCXK(寧)2015-0001，大鼠生長繁殖飼料(No.18053223，北京科澳協力飼料公司)，大鼠和飼料均由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。RMPI-1640培養基、胎牛血清(Gibco公司)；MTT細胞增殖及毒性檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份公司，No.20171213)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司，NO：BB17091)；兔抗P53多克隆抗體、兔抗SIRT1單克隆抗體(艾博抗(上海)貿易有限公司)。人胃腺癌細胞株SGC-7901(中科院上海生科院細胞資源中心提供)。

1.2 藥物

寧夏密點麻蜥由寧夏醫科大學附屬回醫中醫醫院提供，分別制備其頭部、四肢部、軀干部、尾部及全身組，按照人鼠之間用量比例折算，配成濃度為0.28 g/mL水煎液裝瓶備用；0.9%氯化鈉注射液(湖南科倫制藥公司，No.D17090607-1)。

1.3 儀器

超凈工作臺(蘇州安泰公司)；HealForce二氧化碳培養箱(香港力康公司)；OLYMPUS顯微鏡BH-2RFCA；BIO-TEK酶標儀ELx800型等。

2 方法

2.1 含藥血清制備

120只SPF級SD大鼠適應性喂養7天后，隨機分6組：生理鹽水對照組、寧夏密點麻蜥頭部組、四肢部組、軀干部組、尾部組、全身組，每組20只。按每只2.5 mL/100 g給藥，對照組給予等量生理鹽水，連續灌胃7天。末次給藥1 h后，腹腔麻醉，腹主動脈取血、離心，制備含藥血清，-20 ℃冷藏備用。

2.2 胃癌細胞培養

生長于RMPI-1640培養液中的人胃癌細胞SGC-7901，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，每隔48 h更換 1次培養基；實驗時，消化并接種于96孔板或6孔板培養皿中。

2.3 MTT檢測細胞增殖

將對數生長期細胞分別以2×103個/mL濃度接種于96孔培養板中，每孔加入100 μL細胞懸液。培養24 h后吸去上清液，按照實驗分組分別加入用RPMI1640培養液配置的含10%藥物血清100 μL，每組均做5個復孔。各組細胞分別培養24 h，每孔加入50 μL的1xMTT。繼續培養4 h后，吸去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩儀振蕩10 min，待結晶物充分溶解后，用酶標儀在490 nm波長下測吸光值。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

對數生長期細胞分別以6×105/mL接種于6孔板，培養24 h，待細胞貼壁后，吸去上清液，加入含10%大鼠血清的培養液，繼續培養24 h，PBS清洗細胞1次，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，進行4 ℃ 2 000 rmp，離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌細胞2次，吸盡PBS，用400 μL 1×Annexin V結合液懸浮細胞，在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混勻后2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μ LPI染色液，混勻于28 ℃避光條件下孵育5 min，以流式細胞定量分析。

2.5 Western-blot檢測Sirt1和P53蛋白表達

用含10%大鼠含藥血清的RPMI-1640培養液，轉染對應各組細胞72 h后收集細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取25 μg樣品上樣于十二烷基硫酸鈉-上樣緩沖液(SDS-PAGE)，電泳至溴酚藍跑到膠底部。將其轉至硝酸纖維脂膜上，以5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉；分別加入Sirt1和P53一抗，搖床孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，分別加入二抗，搖床孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，進行圖像采集，計算Sirt1和P53蛋白與內參p-actin灰度值的比值，重復3次。

2.6 統計分析

SPSS 20.0 For Windows統計分析。對數據進行正態分布檢驗，符合正態分布者采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)的最小顯著差法，不符合正態分布者進行數據轉化后比較，結果以均數±標準差表示(顯著性水準取α=0.05)。

3 結果

3.1 寧夏密點麻蜥不同部位含藥大鼠血清干預后各組吸光度(OD)值

寧夏密點麻蜥各組OD值低于生理鹽水對照組，P<0.05，表明密點麻蜥各組可較好抑制胃癌細胞增殖；寧夏密點麻蜥各組間比較，以尾部組OD值最低，P<0.05，說明尾部組對胃癌細胞增殖的抑制作用最強(見表1)。

表1 寧夏密點麻蜥不同部位各組含藥血清干預后OD值

注：*各組與生理鹽水對照組比較，*P<0.05；★各組與尾部組比較，★P<0.05。

Note:Compared with control group of saline,*P<0.05;Compared with tail group,★P<0.05。

3.2 寧夏密點麻蜥不同部位含藥大鼠血清對SGC-7901胃癌細胞凋亡影響

寧夏密點麻蜥各組促進人胃癌細胞的總凋亡率高于生理鹽水對照組，P<0.05，表明密點麻蜥各組可較好促進胃癌細胞凋亡；寧夏密點麻蜥各組間比較，以尾部組總凋亡率最高，P<0.05，說明尾部組促進胃癌細胞凋亡的作用最強(見表2、圖1)。

3.3 Western blot檢測STIR1和P53蛋白表達

從圖2可知，與生理鹽水對照組比較，各含藥血清處理組Sirt1和P53蛋白表達均降低，P<0.05。圖3、圖4中Western blot檢測結果表明，寧夏密點麻蜥尾部組Sirt1和P53蛋白水平下降最明顯，各組比較，P<0.05。

3 討論

胃癌屬“胃脘痛”“伏粱”“噎膈”“積聚”等范疇。中醫學認為，飲食、情緒失調及Hp濕熱“蟲”毒感染等引起脾胃升清降濁功能失常，氣血生化乏源，胃黏膜失卻濡養，久則濁毒稽留，絡脈瘀阻而致癌病形成。因此，我們結合文獻及臨床研究，提出毒瘀交阻、氣陰不足是胃癌的主要病機，此與現代醫學細胞缺血缺氧微環境改變而致細胞凋亡失常、細胞惡性增殖致胃癌發生的病理相一致。

因此，促進細胞凋亡、抑制惡性增殖是阻斷腫瘤發生的關鍵環節?，F代胃癌機制研究主要集中在能夠引起細胞增殖、分化的基因和蛋白質表達上[9,10]，如SIRT1、P38、P53、Stats通路、Wnt通路、survivin-caspase-3基因表達、NF-κB等。而SIRT1調控的P53及P53正向細胞凋亡調控因子 (P53 up-regulatedmodulator of apoptosis protein，PUMA)，也稱為bcl-2 binding component 3 protein(BBC3)，因作用獨特、促凋亡活性強大而受到越來越多的關注，在胃癌阻斷機制中起重要的調控作用[11-13]。

表2 寧夏密點麻蜥不同部位含藥大鼠血清對胃癌細胞凋亡影響

注：*各組與生理鹽水對照組比較，*P<0.05；★各組與尾部組比較，★P<0.05。

Note:Compared with control group of saline,*P<0.05;Compared with tail group,★P<0.05。

圖1 寧夏密點麻蜥不同部位含藥大鼠血清對胃癌細胞凋亡影響Fig.1 Effect of drug containing rats serum in lizard’s different parts on apoptosis of gastric cancer cells

圖2 Sirt1 and P53蛋白表達Fig.2 Sirt1 and P53 expression levels注：A對照組；B頭部組；C四肢組；D軀干組；E全身組；F尾部組。Note:A.control group;B.head group;C.limb group;D.trunk group;E.body group;F.tail group.

目前，發現人類sirtuin家族成員有7個，SIRT1是與酵母Sir2基因同源性最高的一個參與細胞衰老、凋亡、分化等生理活動，可能是所有生物共有的壽命調節基因之一[14]。研究表明，SIRT1作用底物中P53是很重要的一個。P53是目前研究最多的抑癌基因，發生變異者為突變體，不但喪失抑癌活性，反而可促進惡性轉化，由抑癌基因轉變為癌基因。已經證實，當細胞處于缺血缺氧致使DNA損傷等應激情況時，P53蛋白表達與多種惡性腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移及預后有關。同時，P53過度表達又可導致腫瘤血管生成增加，是與血瘀證相關的重要因子[15]。

我們前期開展了蜥蜴相關文獻研究，李時珍《本草綱目》載蜥蜴可“滑竅破血，消水飲陰”，《中藥大辭典》亦指出，蜥蜴具有破結利水、消癭散結之效，表明其功效與毒瘀交阻的胃癌病機相符合，臨床以蜥蜴胃康方治療胃癌前病變療效顯著。此外，通過寧夏密點麻蜥干預胃癌前病變(PLGC)模型大鼠的實驗研究表明，寧夏密點麻蜥能抑制PLGC模型大鼠HIF-1α和VEGF表達，可改善胃黏膜細胞缺血缺氧的微環境，抑制凋亡相關蛋白P53、PUMA表達,可有效逆轉胃黏膜增生腸化,抑制癌變趨勢，具有較好的生物活性。進而我們以寧夏密點麻蜥含藥大鼠血清干預人胃癌細胞，發現其能升高P53、Bax及E-cad蛋白表達水平,降低MMP-9蛋白表達,抑制人胃癌細胞BCG-823細胞增殖,促進細胞凋亡，阻斷癌變，E-cad、MMP-9均為細胞上皮間質轉化相關因子，與胃癌浸潤轉移有關，表明寧夏密點麻蜥可干預胃癌的浸潤轉移，療效優于5-FU及華蟾素片組[2-8]。以上研究說明寧夏密點麻蜥具有較好阻斷癌變的作用，但其活性部位尚不明確。

寧夏密點麻蜥生活在沙漠中，從臨床及前期實驗研究結果來看，其生物活性較草原蜥蜴更強，蜥蜴斷尾再生表明蜥蜴尾部含有較強的生物活性物質。陳紹軍也指出，蜥蜴尾部再生分化對機體有較好的保護和功能恢復作用[16]，但缺乏有力實驗數據的支持，基于此，我們進一步開展了寧夏密點麻蜥不同部位抗腫瘤細胞凋亡的研究，以其明確蜥蜴抗腫瘤活性部位，為進一步探討其抗腫瘤活性物質基礎奠定基礎。

本實驗研究結果表明，寧夏密點麻蜥不同部位各組可明顯抑制SGC-7901胃癌細胞增殖，誘導凋亡，以尾部組吸光度值小于其他組，P<0.05。各含藥大鼠血清干預組細胞總凋亡率大于生理鹽水對照組，寧夏密點麻蜥尾部組細胞總凋亡率大于其他各組，寧夏密點麻蜥不同部位含藥大鼠血清干預組Sirt1和P53蛋白表達各組比較，P<0.05，以尾部組下降最明顯，P<0.05。表明寧夏密點麻蜥尾部干預人胃癌細胞SGC-7901細胞增殖，誘導凋亡，以尾部組作用最強，表明尾部為蜥蜴抗腫瘤活性最強的部位，含有較多的活性成分，其機制可能與解毒通絡、養血活血，改善胃黏膜營養供給，改變缺血缺氧微環境，進而抑制Sirt1，降低P53蛋白表達有關，這為我們下一步研究寧夏密點麻蜥尾部抗癌活性成分提供了科學依據。