高效液相色譜法測定飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量

商軍，華賢輝，張浩然，張亦菲，田愷，徐汀

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

葡萄糖胺鹽酸鹽是一種天然的氨基單糖，可以刺激軟骨細胞產生正常多聚體結構的蛋白多糖，提高軟骨細胞的修復能力，抑制產生損傷軟骨的酶，促進軟骨基質的修復和重建，可延緩骨關節疼痛的病理過程和疾病的進程[1]?，F代工業生產中主要采用甲殼類動物和其他節肢動物的外骨骼為原料，經鹽酸水解，再經活性炭脫色和干燥步驟得到其成品[2]，葡萄糖胺鹽酸鹽已被收錄于中華人民共和國農業部公告第1773號《飼料原料目錄》中，其不僅廣泛應用于醫藥及保健食品領域，而且也已在畜禽養殖業和寵物保健中得到了應用[3]。

目前醫藥及保健食品領域葡萄糖胺鹽酸鹽含量測定的國內外文獻報道主要有以下幾種方法：分光光度法[4]、高效液相色譜(HPLC)- 紫外檢測法[5-6]、HPLC-蒸發光散射檢測法[7-8]、HPLC-示差折光檢測法[9]和HPLC - 熒光光度檢測法[10]，其中分光光度法操作繁瑣費時、人為操作誤差較大；采用HPLC - 蒸發光散射檢測法，ELSD 的響應值與葡萄糖胺鹽酸鹽濃度的關系曲線，在較高濃度范圍內大致呈線性，而在低濃度范圍內呈指數關系；采用HPLC - 示差折光檢測法，示差折光檢測器的靈敏度低，不能實現梯度洗脫，對有干擾峰的樣品不適用；采用HPLC-熒光光度檢測法，需要衍生，操作相對復雜，消耗時間長，上述檢測法的穩定性和重復性，均不如HPLC - 紫外檢測法。目前，標準收載的葡萄糖胺鹽酸鹽原料含量測定方法主要有電位滴定法(歐洲藥典9.0 版)[11]、高效液相色譜法(美國藥典40 版)[12]，國內尚無國家和行業標準，而質量控制的重要指標之一含量測定就非常重要，為此，本方法參考美國藥典40 版，進一步優化相關條件，建立高效液相色譜法測定不同來源和批次的葡萄糖胺鹽酸鹽原料含量，并與電位滴定法進行了對比研究，結果表明，建立的方法具有準確、簡便、專屬性強的特點，可以作為飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量測定的質量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(分離系統e2695，二極管陣列檢測器PDA2998，紫外檢測器2487，美國 Waters公司，配Empower 3軟件)；電位滴定儀(904 Titrando，瑞士萬通公司)；電子天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO 公司，精度為0.01 mg)；純水機(Molatom 1810A，中國重慶摩爾水處理設備有限公司)。

1.2 試藥 葡萄糖胺鹽酸鹽對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為140649～201304，含量為100%)；磷酸氫二鉀(分析純)；磷酸(分析純)；乙腈(色譜純)；磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5，稱取磷酸氫二鉀3.5 g，精確至0.01 g，置1000 mL容量瓶中，加水適量使溶解，加入0.25 mL氨水，用水稀釋至刻度，搖勻；用磷酸調節pH值至7.5±0.2)；0.1 mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液；實驗用水(電阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682一級用水的規定)。飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽由國內4家典型的生產企業各提供3批(企業1的批號為201802173、201803122、201805215；企業2的批號為Y1710015、Y1710023、Y1803001；企業3的批號為20171102、20180116、20180429；企業4的批號為M1811001、M1811002、M1811003)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(長：150 mm，內徑：4.6 mm，粒徑：4～5 μm)；流動相：乙腈 - 磷酸鹽緩沖溶液(70+30，V1+V2)；流速：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：195 nm；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，葡萄糖胺鹽酸鹽對照品溶液(4.00 mg/mL)和葡萄糖胺鹽酸鹽供試品溶液(4.00 mg/mL)的典型色譜圖見圖1，保留時間約為2.5～2.6 min，分離度大于1.5。

圖1 葡萄糖胺鹽酸鹽對照品溶液和供試品 溶液的HPLC色譜圖Fig 1 Chromatogram of standard solution and sample solution of glucosamine hydrochloride

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對照品約0.2 g，精確至0.1 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)適量使溶解，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；經0.45 μm濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取供試品約0.2 g，精確至0.1 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)適量使溶解，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；經0.45 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.3 供試品測定 分別取對照品溶液和供試品溶液，按2.1項的色譜條件操作，分別注入液相色譜儀，得對照品和供試品溶液中葡萄糖胺鹽酸鹽的峰面積，按外標法計算供試品中葡萄糖胺鹽酸鹽含量。

2.4 線性關系考察 分別稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對照品0.15、0.175、0.2、0.225、0.25 g，精確至0.1 mg，分別置50 mL棕色容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)至刻度，搖勻，制成葡萄糖胺鹽酸鹽濃度分別為3.00、3.50、4.00、4.50和5.00 mg/mL的對照品曲線溶液。取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項的色譜條件操作，記錄色譜峰面積，以對照品溶液的濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制對照品曲線，結果見表1。實驗結果表明，在3.00～5.00 mg/mL濃度范圍內，線性關系良好。

表1 葡萄糖胺鹽酸鹽的線性關系(n=3)Tab 1 Linear relationship of glucosamine hydrochloride (n=3)

2.5 精密度試驗

2.5.1 重復性實驗 分別取2.2.1項的葡萄糖胺鹽酸鹽對照品溶液(4.00 mg/mL)1份，按2.1項的色譜條件重復進樣5次，檢驗系統測定的重復性；取201802173一批供試品，按2.2.2項的供試品溶液制備，分別制備成供試品溶液5份，按2.1項的色譜條件進樣，檢驗供試品測定的重復性，結果見表2。實驗結果表明，葡萄糖胺鹽酸鹽對照品峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.02%，保留時間的相對標準偏差(RSD)為0.3%；5份葡萄糖胺鹽酸鹽供試品峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.1%，系統和供試品測定重復性均良好。

2.5.2 中間精密度實驗 取201802173一批供試品，分別于不同日期、不同人員和不同儀器，按2.3項的供試品測定對該批供試品含量進行雙樣測定，結果見表3。實驗結果表明，不同日期、不同人員和不同儀器對批號201802173葡萄糖胺鹽酸鹽含量測定結果的RSD為0.09%。精密度較好。

2.6 穩定性試驗 取2.5.1項的重復性試驗中201802173一批供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、24、30、36 h進樣10 μL，在0～12 h，測得峰面積的RSD為0.7%；在16 h后峰面積有顯著下降，說明供試品有部分降解。實驗結果表明，供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 回收率試驗 分別稱取已知含量的供試品約0.1 g，精確至0.1 mg，共9份，分別置50 mL容量瓶中，另分別稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對照品0.08 g、0.1 g和0.12 g各3份，精確至0.1 mg，依低、中、高分別置上述9個50 mL容量瓶中，加50%乙腈溶液(V1∶V2)適量使溶解，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；經0.45 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液；另取葡萄糖胺鹽酸鹽對照品，按2.2.1項的對照品溶液制備操作，制備成對照品溶液。分別取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項的色譜條件操作，記錄色譜圖，按外標法計算測定結果，結果見表4。實驗結果表明，供試品不同量的葡萄糖胺鹽酸鹽平均回收率為99.1%，標準偏差(SD)為0.6%，RSD為0.6%，方法的準確度較好。

表2 方法的重復性試驗結果Tab 2 Repeatability test results of the method

表3 方法的中間精密度試驗結果Tab 3 Intermediate precision test results of the method %

表4 回收率試驗測定結果Tab 4 Method recovery test results

2.8 檢測限與定量限 精密稱取葡萄糖胺鹽酸鹽對照品0.03028 g，置10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液(V1∶V2)溶解稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，用50%乙腈溶液(V1∶V2)逐級稀釋成系列濃度，吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比(S/N)≥3計算為檢測限，以信噪比(S/N)≥10計算為定量限。檢測限為0.032 mg/mL，定量限為0.12 mg/mL。

2.9 本法與電位滴定法測定含量的比較 取批號為M1811001和Y1710015的供試品，分別按歐洲藥典9.0 版的電位滴定法和本法的HPLC法進行測定，測定的結果采用雙樣本T進行檢驗，由表5和圖2可知，兩法測定供試品批號為M1811001和Y1710015葡萄糖胺鹽酸鹽含量的結果均無顯著差異(P>0.05)。

表5 本法與電位滴定法測定結果比較(n=6)Tab 5 Comparison of the results of this method and potentiometric titration (n=6)

圖2 本法與電位滴定法含量測定結果的分布比較圖Fig 2 Comparisons of determination results between this method and potentiometric titration

2.10 不同實驗室比較測定結果 分別取4家生產企業提供的飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽各3批，按本法由本實驗室(Ⅰ)與4家生產企業實驗室(Ⅱ)測定同批供試品中葡萄糖胺鹽酸鹽含量，結果見表6。實驗結果表明，按本法測定飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量，本實驗室與生產企業實驗室測定的結果基本一致。

表6 供試品比較測定結果(n=3)Tab 6 Comparisons of sample determination results in different laboratories (n=3) %

3 討論與結論

3.1 檢測波長的選擇 由于葡萄糖胺鹽酸鹽分子結構中無共軛雙鍵，基本無紫外吸收，在195 nm和205 nm波長處具有較強的末端吸收，美國藥典(40版)[12]和相關文獻報道[6，13]對原料藥的測定檢測波長均采用195 nm，故本實驗選擇195 nm為本品的檢測波長。

3.2 流動相與流速的優化 目前，從高效液相色譜法測定葡萄糖胺鹽酸鹽含量的文獻報道來看，流動相組成主要有乙腈與磷酸鹽緩沖液[6，12]、乙腈與乙酸銨溶液[13-14]。本研究參考了美國藥典(40版)，采用乙腈與磷酸鹽緩沖液為組成的流動相，并優化了流動相的比例和磷酸鹽緩沖液的pH值，優化結果表明，乙腈比例在65%～75%范圍及磷酸鹽緩沖液pH值在7.2～7.7范圍時保留時間和分離效果均較好，為確保方法的耐用性，選擇了乙腈比例為70%，磷酸鹽緩沖液pH值為7.5±0.2，優化結果見圖3和圖4。美國藥典(40版)采用NH2色譜柱進行分離測定，由于該型柱對葡萄糖胺鹽酸鹽的保留行為較強，故流速為1.5 mL/min，保留時間約為25 min，隨著測定的進行，保留時間的重復性變化較大。為此本實驗采用了C18柱進行分離測定，并對流速進行了優化，優化結果表明，當流速為0.6 mL/min時，葡萄糖胺鹽酸鹽色譜峰與供試品中的基質峰能完全分離，保留時間約為2.5～2.6 min，大大縮短了分析時間，且保留時間的重復性較好。

圖3 流動相中乙腈比例對保留時間和分離度的影響Fig 3 Effect of acetonitrile ratio on retention time and resolution in mobile phase

圖4 磷酸鹽緩沖液pH對保留時間和分離度的影響Fig 4 Effect of pH of phosphate buffer on retention time and resolution

采用高效液相色譜法測定葡萄糖胺鹽酸鹽含量，該方法操作簡便易行、快速，方法的準確性、重復性均較好，可用于飼料原料葡萄糖胺鹽酸鹽含量測定的質量控制。