肺泡Ⅱ型上皮細胞衰老與肺纖維化研究進展

張 乙，徐 洪

(華北理工大學 a.臨床醫學院；b. 公共衛生學院，河北 唐山 063210)

肺纖維化是多種肺部疾病的最終表現，以失控的損傷修復為主要特征，引起了炎性細胞浸潤、成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞轉化，最終導致細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的過度沉積，引起肺泡正常結構和功能的破壞。肺纖維化早期診斷較為困難，無特異性的臨床表現，亦無特異性的治療手段，因此研究肺纖維化發生、發展機制與尋求新的治療靶點，一直是肺部疾病相關研究領域的難點和熱點問題。研究發現，細胞衰老是多種肺部疾病發生、發展的重要因素[1]。本文復習了近年來有關肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ cells, AT2)衰老在肺纖維化發生、發展相關機制的相關文獻。

1 細胞衰老可能是肺纖維化形成的核心機制之一

衰老能夠引起肺內干細胞的減少、線粒體功能失調、氧化應激損傷加劇和端粒酶縮短，最終導致肺內細胞不能保持穩態平衡，是慢性阻塞性肺疾病和特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)等多種肺部疾病發生、發展的重要因素[1]。復制性衰老與端粒酶損傷有關，DNA損傷反應(DNA damage response, DDR)通過激活毛細血管擴張性共濟失調突變激酶(ataxia telangiectasia-mutated gene, ATM)和毛細血管擴張性共濟失調Rad3 相關激酶(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase, ATR)，引起p53介導的短暫增殖停滯，DNA損傷修復成功則重新進入細胞周期，修復失敗則走向衰老或凋亡；過早性/應激相關衰老則與端粒長度無關，通過p16INK4a-Rb信號、p53-p21CIP1信號的活化和相應的細胞周期阻滯，或以p27信號作為靶向，以衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)為主要特點，與肺纖維化的形成關系密切[2-3]。SASP表型能夠激活多種促纖維化信號，包括p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信號和Janus活化激酶(Janus-activated kinases, JAK)信號，并導致核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號的激活，從而引起了炎性介質如白細胞介素(interleukin, IL)、生長因子如轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、趨化因子和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的升高；其他與SASP有關的標記物的信號還包括纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)-哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號等，SASP細胞通過自分泌和旁分泌的形式促進細胞衰老的范圍和程度，并引起慢性炎癥的擴展，并能夠引起巨噬細胞-肺泡上皮細胞-成纖維細胞間促纖維化信號的交互作用[4]。因此，以SASP靶蛋白和靶信號作為治療方向，或上調組蛋白去乙?；?sirtuin 1或6)的表達，或利用特異的靶向微小RNA(micro RNA, miRNA)，或利用二甲雙胍激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)信號，有可能通過拮抗細胞衰老，從而改善肺功能、延緩肺纖維化的進展，即細胞衰老信號可能是抗肺纖維化治療的靶向之一[4]。

然而值得注意的是，細胞衰老可能對器官纖維化起到正、反兩反面的調節作用。在IPF、四氯化碳誘導的肝纖維化和多囊腎等一些衰老相關的疾病中發現，衰老相關成纖維細胞形成SASP并分泌少量的TGF-β1，促進鄰近成纖維細胞轉化活化為纖維化相關成纖維細胞，但敲除p53基因或阻斷衰老途徑后，器官纖維化的進展反而加劇，表現為劇烈的DNA損傷，不可控的細胞增殖和凋亡，ECM分泌紊亂[5-6]。進一步研究則發現，雖然衰老相關成纖維細胞與纖維化相關成纖維細胞均可表達肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)且具有典型的肌成纖維細胞超微結構和收縮特性，但是衰老相關成纖維細胞與ECM有關的mRNA缺失表達，而蛋白水解酶、膠原酶、彈性酶和基質溶酶等表達水平升高，對鄰近的纖維化相關成纖維細胞增殖和遷移具有一定的抑制作用[7-8]。

雖然目前尚無細胞衰老與塵(矽)肺纖維化發生、發展直接相關的文獻報道，但衰老相關因素與塵(矽)肺纖維化進展關系密切。流行病學調查顯示，塵肺病患者接塵年齡與發病工齡呈負相關，即隨著接塵年齡的增加，發病工齡相應縮短[9]。課題組前期研究也發現，與衰老有關的標記物，如p21、磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX, γH2AX)隨大鼠染塵時間增加而增高[10]。其他研究也發現，支氣管一次性灌注構建的小鼠模型肺組織中，也存在著γH2AX表達水平的上調[11]。與衰老有關的自噬、內質網應激和線粒體應激等信號在矽肺發生、發展中的異?；罨?，通過調節p53及其下游信號，參與了對慢性炎癥、膠原沉積、肌成纖維細胞分化和上皮間質轉化等促纖維化信號的調控[12-13]，即在塵(矽)肺纖維化進展中，也可能伴隨了衰老信號的激活。

2 肺泡Ⅱ型上皮細胞的衰老加速了肺纖維化進程

已知AT2在維持肺內穩態中具有重要意義，其主要功能包括增殖成為新的AT2細胞、向AT1細胞分化、分泌表面活性物質，具有肺水轉運功能和免疫功能，因此部分文獻認為AT2細胞的功能異常是肺纖維化形成的重要因素，自噬、內質網應激和線粒體應激導致DDR被激活，除了可以導致AT2細胞的凋亡以外，同時能夠誘導AT2發生衰老，形成SASP表型，是肺纖維化重要的驅動因素[14]。

已經證實AT2細胞衰老多伴有其他表型的轉換，與內質網應激關系密切。在IPF患者以及博來霉素小鼠模型中，均發現了衰老相關指標的上調，且來源于博來霉素小鼠的原代AT2細胞β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)染色陽性，分泌型焦磷酸蛋白(secreted phosphoprotein, SPP)1和MMP2等公認的SASP指標表達均增加，且表現出上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型，予以抗衰老藥達沙替尼(dasatinib)和懈皮素(quercetin)則能夠顯著抑制博來霉素介導的細胞衰老和纖維化病變[15]。內質網應激關鍵蛋白葡萄糖調節蛋白(glucose regulated protein, GRP)78基因敲除小鼠的AT2細胞表現出內質網應激損傷、凋亡、衰老和分化能力下降等表現，并伴隨著TGF-β1信號的異常激活，提示內質網應激是衰老和IPF之間的主要聯系[16]。另有研究也發現，細胞分裂周期蛋白(cell division cycle 42, Cdc42)的缺失表達能夠導致AT2細胞不能分化為AT1細胞，即無法形成新的肺泡結構，且機械張力的增高導致AT2細胞TGF-β信號的異常激活，驅動衰老小鼠發生“外周向中心發展”的進展性肺纖維化，該研究將肺泡再生受損、機械性張力和進展性肺纖維化建立了聯系[17]。

該研究還利用單細胞測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技術將AT2細胞區分為兩種亞群，其中與Cdc42表達缺失的基因與IPF發相關靶基因有類似的特點，多集中在肌動蛋白骨架的調節和黏著斑信號[17]，與肌成纖維細胞分化關系密切[18]。針對3例對照和6例IPF患者肺組織的scRNA-seq研究發現，存在不同作用類型的肺上皮細胞，其中命名為“不確定(indeterminate)”階段的肺上皮細胞伴隨著TGF-β、p53、Wnt等信號的異常激活[19]。來源于博來霉素小鼠肺組織的scRNA-seq研究也發現，老齡鼠AT2細胞炎癥相關指標上調，脂質代謝指標下調[20]。另有研究顯示，AT2分化為AT1細胞在生理與病理狀態下機制不同，并與鄰近成纖維細胞有關[21]。上述研究提示，AT2細胞可能具有多種亞群，除了分泌肺泡表面活性物質、分化為AT1細胞外，其可能還具有其他類型的作用，在病理狀態下也可能具有不同的反應。

3 肺泡Ⅱ型上皮細胞的衰老可能是肺纖維化壁龕形成的重要因素

肺內干細胞主要包括基細胞(還包括Clara細胞)，以表達轉錄因子腫瘤蛋白63(tumor potein 63, Trp63)、細胞角蛋白5、平足蛋白(podoplanin)等為主要特征，可自我更新并分化為氣道基細胞、纖毛細胞和分泌細胞，對于維持氣道上皮完整性具有重要意義[22]。而AT2細胞作為肺內干細胞，與壁龕細胞(成纖維細胞、平滑肌細胞和內皮細胞)、ECM和來源于壁龕細胞的可溶性因子形成的干細胞壁龕共同調節了肺內穩態[23]?；诜尾糠智谐g模型，能夠發現血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)α陽性表達的肺成纖維細胞作為肺壁龕細胞，對于AT2細胞對急性肺損傷的修復具有重要意義，如果阻斷了PDGFα陽性表達的肺成纖維細胞相關信號，則影響AT2細胞的增殖和修復功能；體外培養也發現，與成纖維細胞共培養的AT2細胞更容易產生克隆性增殖，并可向AT1細胞分化[23]。因此肺壁龕是維持肺穩態的重要微環境。

在肺纖維化進展中，AT2細胞存在衰老信號、促纖維化信號、轉分化信號的異常激活，是AT2細胞具有不同的亞群的依據[18-21]，也可以認為AT2細胞在空間上和時間上多個信號的異常激活交織在一起，展現了AT2細胞不同的細胞命運。研究發現，肺泡壁龕(間充質)細胞能夠對Wnt信號發生應答，以PDGFα陽性表達為特征，對于AT2細胞的生長和自我更新具有重要意義；而陽性表達Axin2的壁龕細胞則在損傷后優先分化為肌成纖維細胞，參與損傷修復/纖維化進程[24]。另外一項研究則發現，陽性表達Axin2的AT2細胞是肺內干細胞的主要亞群，能夠接受來自鄰近的成纖維細胞的Wnt分泌信號并保持干細胞特性，即成纖維細胞短程旁分泌Wnt促進AT2細胞的活性和增殖；當發生損傷時，AT2細胞能夠自分泌Wnt信號并暫時擴大干細胞儲備，并向AT1細胞分化，從而進行損傷修復[21]。在病理性條件下，ECM能夠通過整合素信號驅動內源性潛在型TGF-β1信號的激活，促進AT2細胞發生EMT[25]。AT2細胞在TGF-β1誘導的EMT進程中，能夠通過分泌結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)反過來通過自分泌和旁分泌形式活化成纖維細胞，從而促進了纖維化進展[26]。在對石棉肺的研究中發現，組織駐留的肺泡、支氣管周和血管周巨噬細胞和單核細胞來源的巨噬細胞構成了纖維化壁龕，其中清除單核細胞來源的巨噬細胞能夠有效的改善肺纖維化病變，單核細胞來源的巨噬細胞通過M-CSF及其受體信號，通過激活PDGFα從而促進了成纖維細胞的增殖，并調節不同亞群的AT2細胞，這種巨噬細胞-間質(成纖維)細胞和AT2細胞交互作用，是肺纖維化壁龕形成的重要環節[27]。課題組最近的實驗結果也發現，在矽肺纖維化不同的發展階段，AT2細胞呈現不同的特征表型，即正常情況下靜息、巨噬細胞肺泡炎階段增殖/活化、矽結節形成階段失去原有功能(可能是衰老)，最終凋亡。且AT2細胞與巨噬細胞一樣，在染塵早期即激活，可能與其鄰近的成纖維細胞、ECM和巨噬細胞的交互作用形成纖維化壁龕。推測AT2細胞在空間上和時間上多個信號的異常激活交織在一起，展現不同的細胞命運，包括衰老、凋亡，以及由“抗纖維化功能”向“促纖維化功能”轉變，可能是肺纖維化發生、發展的新機制之一。

綜上所述，細胞衰老是肺纖維化發生、發展的重要環節。目前研究發現的與細胞衰老有關的信號和治療靶點，在正常的肺穩態調控中也具有重要意義，對這些已知促纖維化信號的阻斷反而可能會起到相反結果，因此對于肺纖維化的靶向治療應更為精準。以AT2細胞作為靶向細胞，以拮抗細胞衰老作為治療靶點，能夠從逆轉纖維化和維持肺內穩態兩個方面拮抗肺纖維化的形成，可視為今后肺纖維化治療有前景的策略之一。