miR-383靶向PRDX3對肝癌HepG2細胞增殖、侵襲的影響

田 姍，江 海，劉 慧，曹 霞，張 丹，牟尚東，李 曾

1.西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院腫瘤內科，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學生物科學與工程學院；3.西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院血液內科

肝癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，在全國范圍內發病率及死亡率均呈逐漸上升趨勢[1-2]。雖然目前對肝癌的診治技術在不斷改進和完善，但其惡性程度高，術后5年生存率僅50%左右[3]，主要原因是患者確診時多為中晚期，失去最佳手術機會[4]。因此，探尋肝癌新型生物治療靶標已成為臨床研究熱點。有研究發現，利用微小載體攜帶外源RNA進入癌變部位，能夠對癌細胞中相關蛋白合成發揮抑制作用，進一步起到抗癌作用[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性非編碼單鏈RNA，存在于真核生物細胞內，能與靶基因mRNA3′非編碼區特異性結合，調節基因轉錄和表達，在細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等過程中發揮重要作用[6]。Yan等[7]研究發現，miR-383可直接靶向PAX6抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲。有研究報道，miR-383在食管鱗癌[8]、卵巢癌[9]中均發揮抑癌作用，但其在肝癌中的生物學功能及作用機制卻鮮有報道。人過氧化物還原酶-3(human peroxide reductase-3，PRDX3)是硫氧還蛋白過氧化物酶抗氧化劑家族的線粒體成員，是調節細胞氧化還原狀態的線粒體過氧化物還原酶，與腫瘤形成有關[10]。Liu等[11]研究發現，PRDX3促進肝癌的生長并介導細胞增殖、遷移及侵襲，是肝癌潛在治療靶點。王曉玫等[12]研究發現，在人髓母細胞瘤D341細胞系miR-383過表達可靶向調控PRDX3基因表達水平，抑制D341細胞增殖、侵襲及遷移。因此本研究通過檢測miR-383在人肝癌HepG2細胞中表達水平，探討其與PRDX3靶向關系及對肝癌HepG2細胞增殖、侵襲的影響，以期揭示miR-383在肝癌發生、發展中作用，為尋找有效生物學靶標、實現肝癌的精準治療提供一定理論參考?，F將具體結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞HepG2肝癌細胞(貨號：SCS-519)購自中國科學院上海生物科學研究所。

1.2 主要試劑與儀器DMEM培養基(批號:NBG1236)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(批號:36G5782)購自美國Gibco公司；鏈霉素(批號:NBG1236)、青霉素(批號:FH673J)、二甲基亞砜(批號:N6582J)購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒(批號:ME861R)、BCA試劑盒(批號:2763DB)、胰蛋白酶(批號:BD735N)購自上海碧云天公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號:YBP165)購自北京百奧萊博科技有限公司；PRDX3(批號:YBS903)、Ki-67(批號:RM-9106)、MMP-2(批號:35G5642)、MMP-9(批號:J1620032)、β-actin(批號:D648JF)抗體、山羊抗兔HRP(批號:674GN6)二抗購自美國Proteintech公司；6孔細胞板(批號:SU732)購自美國Bio-Rad公司；反轉錄試劑盒(批號:7856GU)購自美國Sigma公司)；AceQqPCR SYBR Green Mix(批號:NC9343)購自南京Vazyme生物公司；Trizol Reagent核酸分離試劑(批號:83H296)購自日本Takara公司；LipofectamineTM3000轉染試劑盒(批號:HUDY03)購自美國Invitrogen公司；miR-383 mimic、miR-383 mimic-negativecontrol由上海生工公司合成。CO2培養箱(型號:NHD DYE1738)購自日本Sanyo公司；普通光學顯微鏡(型號:BNJD7836)購自美國Olympus公司；Elx800酶標儀(型號:HSG9832)購自美國Thermo公司；熒光定量PCR儀(型號:HDBC0291)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養：復蘇HepG2細胞，培養于含質量濃度為150 g/L滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，防止細菌污染，培養于37 ℃飽和濕度、體積分數為5%的CO2、20%的O2培養箱中，每2～3 d更換1次培養液，無菌操作，待細胞生長良好，且達對數生長期時進行后續實驗。

1.3.2 細胞轉染及分組：將培養至對數生長期的HepG2細胞，用質量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化，接種6孔細胞板(1×106個/孔)，待細胞融合度至80%時，更換為無血清DMEM培養基，采用LipofectamineTM3000進行轉染，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，轉染后用無血清DMEM培養基繼續培養24 h。實驗分為3組：(1)空白(normal glucose，NG)組：只含HepG2細胞；(2)miR-383陰性對照(negative control，NC)組：轉染終濃度為100 nmol/L miR-383 NC序列；(3)miR-383過表達(miR-383 mimics)組：轉染終濃度為100 nmol/L miR-383 mimics序列。6 h后棄去培養基，更換為質量濃度為100 g/L胎牛血清DMEM培養基培養。轉染48 h后將培養板置于倒置熒光顯微鏡下觀察，鏡下隨機選擇3個視野，分別計數細胞總數及綠色熒光的細胞數，計算轉染效率，當轉染效率為80%時，加入嘌呤霉素進行壓力篩選，獲得穩定轉染細胞株。

1.3.3 實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-383水平：按照試劑盒說明書提取各組HepG2細胞中總RNA，使用分光光度計測定RNA濃度，OD260/280值為1.8～2.0，代表提取的RNA合格；以RNA為模板，按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應，所得cDNA進行qRT-PCR反應。反應體系20 μl：2×ULtraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl；反應條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環。引物由大連寶生生物工程有限公司設計并合成，以U6作為內參基因。采用2-ΔΔCt方法計算各組HepG2細胞中miR-383相對表達量。引物設計見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence

1.3.4 MTT法檢測HepG2細胞增殖能力：取1.3.2各組穩定表達miR-383的HepG2細胞，將細胞接種于96孔板進行培養，細胞密度為5×104個/孔，分別培養0、24、48、72、96 h后向各孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后，棄去上清，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解。在酶標儀中570 nm處測定各孔OD值，重復3次，取平均值。計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)=(空白組OD值-實驗組OD值)/空白組OD值×100%。

1.3.5 Transwell法檢測各組HepG2細胞侵襲能力：Transwell小室上室底膜表面鋪Matrigel膠(20 μl 2.0 mg/ml)，室溫孵育40 min，收集1.3.2轉染后的HepG2細胞，采用不含胎牛血清的DMEM培養基調整HepG2細胞濃度(2×105個/ml)，然后在Transwell小室的上室加入100 μl細胞懸液，在下室加入質量濃度為100 g/L的胎牛血清的DMEM培養基(600 μl)，放入培養箱繼續培養24 h，取出小室，棄上室培養液，采用無水甲醇固定，30 min后擦去上室未透過膜的細胞，結晶紫(0.2%)染色20 min，將其置于倒置顯微鏡下觀察計數。每組實驗重復3次。

1.3.6 Transwell法檢測各組HepG2細胞遷移能力：取1.3.2轉染后的HepG2細胞，采用不含胎牛血清的DMEM培養基調整HepG2細胞濃度(2×105個/ml)，然后在Transwell小室的上室加入100 μl細胞懸液，在下室加入含質量濃度為100 g/L的胎牛血清的DMEM培養基(600 μl)，放入培養箱繼續培養24 h，取出小室，棄上室培養液，采用無水甲醇固定，30 min后擦去上室未透過膜的細胞，結晶紫(0.2%)染色20 min，將其置于倒置顯微鏡下觀察計數。每組實驗重復3次。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測miR-383對PRDX3的轉錄調控：(1)熒光素酶報告基因實驗突變型載體的制備：TargetScan數據庫顯示人PRDX3基因3′UTR區域含2個miR-383結合位點。對含2個位點的PRDX3-3′UTR區域進行擴增，連到PGEM-T載體上，測序篩選，酶切連至pGL4熒光素酶報告載體，構建p-GL3-PRDX3-3′UTR質粒，以此質粒為模板進行定點缺失(Del1：374～380位點；Del2：809～815位點)突變，測序確認突變成功，構建p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del2、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1，2質粒。(2)熒光素酶報告基因實驗：HepG2細胞鋪48孔板，24 h后，將p-GL4-PRDX3-3′UTR野生型與miR-383 NC共轉染，將p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del2、p-GL4-PRDX3-3′UTR-Del1，2質粒分別與miR-383 mimics共轉染，每組設6個復孔。轉染后24 h，收集細胞，加入100 ml熒光素酶檢測試劑Ⅱ，測定熒光強度，記作A，之后加入Stop & Glo，測定熒光強度，記作B，采用A/B表示熒光素酶相對活性。

1.3.8 蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達：收集各組HepG2細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，并采用BCA法檢測PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9總蛋白濃度，分別取20 μg蛋白上樣于SDS-PAGE分離蛋白，將各蛋白轉至PVDF膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，加入PRDX3(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗，加入HRP標記山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，采用ECL發光試劑顯影，采用Tanon 600圖像分析系統拍照，以β-actin為內參分析PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 各組轉染效果檢測結果倒置熒光顯微鏡下觀察NC組、miR-383 mimics組細胞轉染效果，miR-383 mimics組鏡下可見綠色熒光，HepG2細胞成功轉染miR-383(見圖1)。miR-383 mimics組HepG2細胞中miR-383表達水平(1.42±0.23)顯著高于NG組(0.87±0.19)、NC組(0.88±0.19)(P<0.05)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察細胞轉染效果(100×)A:NC組；B:miR-383 mimics組

2.2 miR-383過表達對HepG2細胞增殖能力影響隨著培養時間的延長，miR-383 mimics組HepG2細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，不同時間點miR-383 mimics組HepG2細胞增殖抑制率均顯著高于NG組、NC組(P<0.05)(見表2)。

表2 miR-383過表達對HepG2細胞增殖能力的影響Tab 2 Effect of miR-383 overexpression on proliferation of HepG2 cells

2.3 miR-383過表達對HepG2細胞遷移能力的影響

與NG組、NC組比較，miR-383過表達組HepG2細胞遷移數明顯減少(P<0.05)(見圖2、表3)。

2.4 miR-383過表達對HepG2細胞侵襲能力的影響

與NG組、NC組比較，miR-383過表達組細胞侵襲數明顯減少(P<0.05)(見圖2、表3)。

圖2 miR-383過表達對HepG2細胞遷移、侵襲能力的影響Fig 2 Effects of miR-383 overexpression on migration and invasion of HepG2 cells

表3 miR-383過表達對HepG2細胞遷移、侵襲能力的影響Tab 3 Effects of miR-383 overexpression on migration and invasion of HepG2 cells

2.5 miR-383靶向調控PRDX3基因的關系驗證Targetscan(http://www.targetscan.org/)預測結果顯示，PRDX3基因3′UTR區有2個miR-383結合位點，分別位于miR-383 3′UTR374-380和809～815。熒光素酶報告基因實驗結果見圖3，與PRDX3-3′UTR+NC組比較，PRDX3-3′UTR+mimics組的熒光素酶活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；mimics各突變型PRDX3組的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。

注：與PRDX3-3′UTR+NC組比較，aP<0.05；Del1：374～380位點突變；Del2：809～815位點突變。圖3 熒光素酶報告基因實驗檢測miR-145與MY06基因3′UTR區域的結合Fig 3 Luciferase reporter gene assay was used to detect the binding of miR-145 with 3′UTR region of MY06 gene

2.6 miR-383過表達對HepG2細胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響與NG組、NC組比較，miR-383 mimics組HepG2細胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)(見圖4、表4)。

圖4 miR-383過表達對HepG2細胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

表4 miR-383過表達對HepG2細胞PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

3 討論

肝癌作為一種惡性腫瘤，其發病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已是腫瘤轉移或晚期，因此具有高發病率、高死亡率特點。目前仍缺乏有效的早期篩查和診斷肝癌的生物學指標。

成熟miRNA是長度為20～23個核苷酸的單鏈RNA分子，是基因表達的重要調節劑，通常會降低mRNA穩定性，包括介導腫瘤發生過程基因的mRNA。miRNA靶向主要是通過miRNA 5′端(“種子”區域)與mRNA編碼區和非翻譯區(UTR)內位點之間特定堿基配對相互作用實現的[13-14]。Cui等[15]研究發現，在結腸癌中，miR-383的上調可能通過靶向APRIL的調節來抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Ma等[16]研究發現，miR-383通過靶向調節EPAS1而抑制肺癌細胞增殖、侵襲及遷移，miR-383可能作為治療肺癌的潛在生物學靶標。以上研究結果說明，miR-383在惡性腫瘤發生、發展中多作為抑癌基因發揮作用。然而，有關miR-383在肝癌發生、發展中的作用及機制研究較少。本研究結果發現，miR-383過表達后肝癌HepG2細胞增殖抑制率明顯升高，細胞遷移、侵襲能力均顯著下降，提示miR-383過表達可顯著抑制HepG2細胞增殖、遷移、侵襲。

本研究采用TargetScan數據庫對miR-383靶基因預測發現，PRDX3是miR-383潛在靶基因。PRDX3是PRXS家族重要成員，其定位于線粒體中并由核基因進行編碼，可靶向線粒體的氨基酸序列，在內質網合成后經線粒體定位信號轉運發揮作用，能夠維持線粒體內氧化還原反應動態平衡及腫瘤形成[17-18]。研究表明，PRDX3促進肝癌的生長并介導細胞遷移和侵襲，是肝癌治療的潛在治療靶點。Shi等[19]研究發現，肝癌患者的血清PRDX3表達顯著高于肝硬化患者及健康對照組，且血清PRDX3表達高的肝癌患者的中位生存時間比PRDX3表達低的肝癌患者的中位生存時間短，可作為非侵入性生物標志物用于肝癌的診斷或預后。王少增等[20]研究發現，PRDX3在人髓母細胞瘤組織及Daoy細胞系中過表達，而miR-383可能通過下調PRDX3的表達水平來抑制Daoy細胞系的增殖，并促進其凋亡。本研究發現，miR-383可顯著抑制野生型PRDX3組熒光素酶活性，PRDX3基因3′UTR區與miR-383任一結合位點發生突變均可以恢復熒光素酶活性，提示miR-383可靶向調控PRDX3基因。進一步研究顯示，miR-383過表達可顯著抑制肝癌HepG2細胞中PRDX3、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達，表明在HepG2細胞細胞中，miR-383過表達可顯著抑制PRDX3基因轉錄和翻譯，并可能通過抑制增殖、侵襲、遷移相關蛋白進而抑制細胞增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，miR-383在肝癌HepG2細胞中呈低表達，其可能通過下調PRDX3表達抑制HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-383可能作為潛在靶標為肝癌基因治療提供新方法。本研究存在不足之處，關于肝癌中miR-383靶向PRDX3具體調控過程，需深入研究并進行驗證。