血漿miR-93、miR-144檢測在食管癌患者預后評估中的價值

徐露娟，洪永貴，宋學坤，郭勝男，曹 恒，溫艷艷

1.安陽市腫瘤醫院內一科，河南 安陽 455000；2.河南中醫藥大學健康大數據與生物醫學信息學實驗室

世界范圍內食管癌發病率在36種癌癥中排第7位，死亡率排第6位，而中國食管癌發病率為全球前五，遠高于世界平均水平[1]。多數食管癌患者確診時已為中晚期，手術及放化療效果較差，導致預后極差、生存率較低[2]。微小RNA是一類高度保守的內源性小型非編碼調控核糖核酸，Ansari等[3]發現，miR-93在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)腫瘤組織中表達顯著高于非腫瘤組織，認為miR-93可能在ESCC中發揮重要作用，miR-93可用作ESCC的潛在生物標志物。Xie等[4]發現，miR-144在食管癌患者唾液中的表達水平較健康對照組上調。Du等[5]研究認為，miR-144在食管癌患者唾液中可能靶向Notch同源物1，已知Notch同源物1作為心臟特異性靶標可引起心臟異常，在右心室形態發生改變過程中有一定作用[6]。但miR-93、miR-144表達情況與食管癌患者預后關系的相關研究較少，因此本研究針對miR-93、miR-144在食管癌患者血漿中的表達水平，探討二者與食管癌患者預后情況的關系，以期未來可對食管癌預后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2017年6月至2019年6月經本院檢查并確診為食管癌的患者64例作為觀察組，男35例，女29例，年齡(49.21±8.13)歲(45～55歲)；按照美國癌癥聯合委員會(AJCC)/國際抗癌聯盟(UICC)關于食管癌的TNM分期系統(第八版)[7]對患者進行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期31例。另選取同期在本院體檢的健康者60名作為對照組，男33例，女27例，年齡(47.25±9.51)歲(43～54歲)。兩組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組入選標準：(1)經病理組織學或細胞學診斷為食管癌；(2)入組患者均行食管癌根治術，且就診前未行手術、放射、化療或激素治療；(3)患者腫瘤為原發；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)心、腦、腎等重要器官功能障礙；(2)急性、亞急性或隱性感染性疾??；(3)凝血系統障礙，有出血疾病者；(4)合并其他部位腫瘤疾病者。所有受試者均對本研究知情同意并自愿簽署知情同意書，本研究獲本院醫學倫理委員會審查批準(倫理批號：201705-12)。

1.2 主要試劑與儀器逆轉錄試劑盒(貨號：DEM201-20T)購自北京拜爾迪生物技術有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(貨號：RR037A)及TRIzol試劑(貨號：JMS12279)均購自日本TaKaRa公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：MiniAmp)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集：兩組測試對象均于早晨空腹采集靜脈血6 ml，肝素抗凝，室溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，吸取上層淡黃色血漿轉移至新離心管中，均于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 qRT-PCR法測定受試者血漿中miR-93、miR-144表達水平：從-80 ℃冰箱取出血漿樣本，按試劑盒說明書提取血漿總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100 μl DEPC水，檢測所得RNA純度及完整度；按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，產物置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應(反應體系10 μl)：cDNA(50 ng/μl)模板1 μl，SYBR Green PCR Master Mix 4.5 μl，上下游引物各0.4 μl，無酶水3.7 μl，每個樣本設置3個平行。上下游引物由上海恒斐生物科技有限公司設計并合成，miR-93、miR-144以RUN6B為內參，引物序列見表1，反應條件：95 ℃預變性6 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，每個循環72 ℃收集熒光。采用2-ΔΔCt法計算血漿中miR-93、miR-144相對表達量。

表1 miR-93、miR-144基因qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence of miR-93 and miR-144 genes

1.4 隨訪及預后評價以患者手術時間為觀察起點，患者死亡、失訪或最后一次隨訪時間為終點，通過電話、微信等聯系方式進行隨訪，每30 d隨訪1次，記錄患者死亡原因。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較兩組患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、熱食、食管癌家族史比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 兩組一般資料比較Tab 2 Comparison of general data between two groups

2.2 兩組血漿中miR-93、miR-144表達水平觀察組血漿中miR-93、miR-144 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組miR-93、miR-144表達水平比較Tab 3 Comparison of expression levels of miR-93 and miR-144 between the two groups

2.3ROC曲線分析食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達水平ROC曲線分析發現，區分食管癌患者血漿中miR-93、miR-144高低表達的截斷值分別為1.70、2.05，低于截斷值者為低表達組，高于截斷值者為高表達組(見圖1)。

圖1 ROC曲線分析食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達水平Fig 1 ROC curve analysis of the expression levels of miR-93 and miR-144 in plasma of esophageal cancer patients

2.4 食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達水平與臨床病理特征的關系食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達水平與年齡無關，與TNM分期、分化程度和淋巴結轉移有關(P<0.05)(見表4)。

表4 食管癌患者血漿中miR-93、miR-144表達與臨床病理特征的關系Tab 4 The relationship between the expressions of miR-93, miR-144 in the plasma and clinicopathological characteristics of esophageal cancer patients

2.5 食管癌患者的預后比較對所有食管癌患者進行為期6個月的隨訪，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。miR-93高表達組28例，死亡15例；miR-93低表達組36例，死亡2例。食管癌患者miR-93低表達組6個月生存率明顯高于高表達組(log-rank值為8.597，P=0.003)；miR-144高表達組37例，死亡14例；低表達組27例，死亡3例。食管癌患者miR-144低表達組6個月生存率明顯高于高表達組(log-rank值為7.557，P=0.006)(見圖2～3)。

圖2 食管癌患者血漿miR-93表達與總生存率的關系Fig 2 The relationship between the expression of miR-93 and the overall survival rate in patients with esophageal cancer

圖3 食管癌患者血漿miR-144表達與總生存率的關系Fig 3 The relationship between the expression of miR-144 and the overall survival rate in patients with esophageal cancer

2.6 影響食管癌患者預后的多因素分析COX多因素分析顯示，miR-93高表達、miR-144高表達、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期是預測食管癌患者術后生存期的獨立危險因素(P=0.002、0.024、0.036)(見表5)。

表5 影響食管癌患者預后的多因素分析Tab 5 Multivariate analysis of prognosis in patients with esophageal cancer

3 討論

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，我國的食管癌90%以上為ESCC，少數為腺癌。食管癌患者就診時絕大多數已屬于中晚期，目前食管癌的主要治療手段仍是手術、放射治療和化療[8-9]，但治療后病死率及并發癥發生率較高，嚴重影響患者預后及生存質量。研究食管癌預后相關生物標志物對提高患者生存率和改善患者生存質量有重要意義。

miR-93屬于miR-106b-25 miRNA簇，近年來有研究[10]發現，miR-93在多種消化道腫瘤組織或細胞中過表達，且與腫瘤的轉移和治療耐藥性等密切相關。宋衛敏等[11]發現，miR-93在ESCC組織中的表達量較對應的癌旁組織明顯升高，miR-93表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關。Fabbri等[12]發現，神經母細胞瘤細胞系中miR-93高表達，可通過靶向上調表皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)的表達，促進腫瘤血管生成。本研究結果中，與健康對照組相比，miR-93表達水平在食管癌患者血漿中高表達，結果與Ansari等[3]研究相似，且與食管癌患者TNM分期、分化程度和淋巴結轉移密切相關，說明血漿miR-93水平變化可能與食管癌發生、發展有關，miR-93高表達可能具有促進食管癌組織生長的作用，也調控某種炎性因子以加重癌細胞所處炎癥環境，從而加速食管癌發展進程。

由于miRNAs以穩定的形式存在于各種體液包括血液、尿液及糞便中，miR-144則在多種疾病中發生顯著的變化，使其可以作為多種疾病特異、敏感的生物標志物，但目前miR-144的作用靶點及機制不明確[13]。Shao等[14]發現，相較癌旁正常細胞，ESCC細胞中miR-144表達降低，在ESCC細胞系中miR-144轉染抑制細胞增殖、遷移和侵襲的能力更強。Xiao等[15]研究發現，miR-144過表達可促進腎透明細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲，增強腎透明細胞癌惡性程度和對化療藥物耐藥性。有動物研究[16]發現，反流性食管炎大鼠食管黏膜miR-144表達水平升高，氧化應激、黏膜屏障相關指標表達顯著升高。本研究中miR-144表達在食管癌患者血漿中呈高表達，與Sharma等[17]研究顯示miR-144在食管癌患者血清樣本中顯著上調結果相一致；且與食管癌患者TNM分期、分化程度和淋巴結轉移有關，提示miR-144可能參與食管癌進展，miR-144高表達或與食管癌黏膜屏障受損、食管癌所導致的炎癥應激有關。miR-93和miR-144均可能參與促進腫瘤進展的某種機制，但尚不清楚是否存在共同的通路或靶標，仍需進一步研究。

Kaplan-Meier生存曲線顯示，食管癌患者miR-93、miR-144低表達組6個月生存率均高于高表達組，提示miR-93、miR-144高表達可能是影響食管癌患者死亡發生的危險因素。COX多因素分析顯示，miR-93高表達、miR-144高表達、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期是預測食管癌患者術后生存期的獨立危險因素，提示在食管癌發生過程中miR-93、miR-144高表達可能預示食管癌患者術后生存期短等不良預后發生。

綜上所述，miR-93、miR-144在食管癌患者血漿中呈高表達，與患者TNM分期、分化程度和淋巴結轉移有關，是影響食管癌患者不良預后發生的獨立危險因素。但本研究仍存在一些不足，如樣本量過小，未來可通過擴大研究對象群體或延長研究時間來解決這一問題；miR-93、miR-144是否存在共同靶標或機制，亟待進一步研究。