CCL7通過ERK/JNK通路影響肝癌細胞的侵襲和遷移

陳對對，楊 強 ，葉 子，陳祖兵，沈世強

武漢大學人民醫院肝膽外科，湖北 武漢 430060

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)是我國第四位常見腫瘤和第三大致死腫瘤類型[1]，其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占PLC的75%～85%，盡管肝癌的靶向治療、免疫治療不斷取得突破，且治療方法在向個體化、系統化、綜合化發展[2]，但肝癌易侵襲和轉移的特性是導致患者預后不良的主要原因之一。趨化因子[3](Chemokine)作為一種小分子蛋白，與炎癥反應、白細胞運輸、腫瘤轉移及血管生成等密切相關。趨化因子7[chemokine (C-C motif) ligand 7，CCL7],也叫單核細胞趨化蛋白3(monocyte chemotactic protein 3,MCP-3)，是趨化因子家族中的一員，與腫瘤的侵襲和轉移相關[4]。目前CCL7在肝癌中的作用及機制鮮有相關報道。本研究探討CCL7與肝癌細胞侵襲和遷移能力的關系，為肝癌的治療進一步提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料人正常肝細胞株L02和人肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2均購自中國科學院細胞庫; RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司(SH30809);DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司(SH30022);胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司(141215)；胰酶Trypsin購自吉諾生物醫藥技術有限公司(GNM25200)；重組人CCL7購自Peprotech公司(300-17)；CCL7 siRNA購自銳博公司(p201909090011)；Rutin hydrate購自美國MCE公司(HY-N0148A)；E-cadherin抗體(#14472)、Snail抗體(#3879)、JNK抗體(#9252)、p-JNK抗體(#4668)、ERK抗體(#4695)、p-ERK抗體(#4376)均購自CST公司;Vimentin抗體(ab92547)、Twist抗體(ab50887)均購自英國Abcam公司;HRP-Goat anti Rabbit二抗購自ASPEN公司(AS1107)；人CCL7酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒購自ELK Biotechnology公司(ELK1167)；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司(C0038)；EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒購自美國ELK Biotechnology公司(EQ001)。

1.2 細胞培養HepG2細胞用89% DMEM高糖培養基+質量濃度為100 g/L胎牛血清+1%雙抗培養，L02細胞和SMMC-7721細胞用RPMI-1640培養基+質量濃度100 g/L胎牛血清+1%雙抗培養。所有細胞用25 cm2透氣蓋培養瓶培養，放置于含體積分數為5%的CO2的37 ℃培養箱中。細胞貼壁繁殖生長達瓶底面積85%左右時用胰蛋白酶進行消化傳代。

1.3 細胞轉染取1×105個/ml的SMMC-7721細胞接種在24孔板上，培養24 h后將原有培養基棄去，加入2 ml含血清的RPMI-1640細胞培養基。置于體積分數為5%的CO2培養箱中于37 ℃培養至細胞匯合為30%～50%。用30 μl Opti-MEM無血清培養稀釋1.25 μl 20 μmol/L siRNA存儲液，輕輕混勻。加入3 μl riboFECTTMCPReagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min，制備成轉染復合物。將riboFECTTMCPReagent轉染復合物加入到適量無雙抗完全培養基中，輕輕混勻。將培養板置于37 ℃的體積分數為5%的CO2培養箱中培養48 h。通過qRT-PCR和Western blotting方法觀察或檢測轉染基因的表達情況。

1.4 ELISA檢測分別收集L02、HepG2、SMMC-7721、si-NC、si-CCL7細胞，4 ℃，2 000 r/min，10 min離心，棄去不溶物，取上清。確定用于稀釋標準液、空白液和樣品的孔。準備7個標準孔，1個空白孔。取100 μl標準品、空白品和樣品的稀釋液分別添加到適當的孔中。平板封口機蓋住孔。在37 ℃下孵育2 h。清除每個孔中的液體。吸出溶液，并用250 μl洗滌溶液清洗每個孔，靜置1～2 min。將板卡在吸水紙上，完全清除所有孔中的殘留液體。完全清洗3次。最后一次清洗后，抽吸或傾析除去所有剩余的洗滌緩沖液。翻轉板并將其吸在吸水紙上。向每個孔添加100 μl生物素化抗體工作溶液，用平板密封劑蓋住孔，并在37 ℃下孵育1 h。向每個孔中加入100 μl鏈霉親和素-HRP工作溶液，用平板密封劑蓋住孔，并在37 ℃下孵育1 h。重復吸取/沖洗過程，共5次。向每個孔中添加90 μl TMB底物溶液。蓋上新的平板。在37 ℃下避光孵育15 min。加入TMB底物，液體將變成藍色。向每個孔中分別添加50 μl終止試劑。液體將變成黃色。敲擊板的側面混合液體。Stop試劑的插入順序應與TMB底物溶液的插入順序相同。除去平板底部的水滴和指紋，并確認液體表面無氣泡。最后，使用酶標儀并立即在450 nm下進行測量。上述操作按照Human MCP3 ELISA Kit試劑盒進行。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖將對數生長期SMMC-7721細胞用胰蛋白酶消化，配制成細胞懸液，按1×104個/孔接種于96孔板，置于體積分數為5%的CO2培養箱中37 ℃下培養24 h以貼壁。后分別更換為100 μl細胞樣品含100 ng/ml、200 ng/ml CCL7濃度藥物的培養基，對照組更換為含溶劑的培養基。每個濃度的樣本設5個重復。所有孔中加入10 μl CCK-8溶液，培養箱中孵育1～4 h。使用酶標儀測定450 nm吸光度值(OD值)，以溶劑處理的細胞為對照組，不含細胞的培養基為空白對照組，按公式計算藥物對細胞的存活率。細胞存活率%=(實驗組-空白對照組)/(陰性對照組-空白對照組)×100%。

1.6 Transwell小室遷移及侵襲實驗遷移實驗用Corning公司的8 μm孔徑的Transwell小室，侵襲實驗用BD公司的8 μm孔徑的鋪膠Transwell侵襲小室，實驗前將鋪膠Transwell侵襲小室水化2 h。收集轉染的細胞、200 ng/ml CCL7共培養細胞，胰酶消化重懸計數，調整濃度值為1×105個/ml，Transwell小室及鋪膠Transwell侵襲小室的上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl完全培養基。培養箱中培養24 h后取出，吸去上室及下室培養基，PBS輕輕清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，棉簽擦去未穿過的細胞，100倍光學顯微鏡下計數穿過細胞數，隨機選取5個視野，取其平均值用于統計。

1.7 Western blotting將空白對照組、si-NC組、si-CCL7組、CCL7組、JNK/ERK通路抑制劑組和CCL7+JNK/ERK通路抑制劑組細胞分別種植于6孔板，待細胞貼壁，融合度為70%～90%時，用PBS緩沖液潤洗貼壁細胞2～3次。加入RIPA裂解液(每孔加入150 μl)，提取細胞蛋白；BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉1 h后，加入E-cadherin抗體、Snail抗體、JNK抗體、p-JNK抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、Vimentin抗體、Twist抗體；4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后，加入HRP-Goat anti Rabbit二抗 (1∶1 000)，37 ℃溫育30 min，用TBST在室溫下搖床上洗4次，每次5 min。增強化學發光系統顯色。利用投射儀圖像分析系統掃描確定X線片上雜交條帶的OD值，實驗獨立重復3次，以3次實驗所得OD值的平均數表示蛋白含量。

1.8 qRT-PCRTRIzol法提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，在Life technologies公司的StepOneTMqRT-PCR儀上完成，每個樣品均作3個復孔，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行(ELK Biotechnology，EQ001)。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2 結果

2.1 CCL7在肝癌細胞中高表達通過ELISA分析CCL7在人正常肝細胞系L02、肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2中的表達情況，結果如圖1所示，CCL7在SMMC-7721、HepG2細胞中的表達量顯著高于其在正常肝細胞L02中的表達量，差異有統計學意義(P=0.003、P=0.0037)。

圖1 L02、SMMC-7721和HepG2細胞中CCL7蛋白的表達情況Fig 1 The expressions of CCL7 protein in L02, SMMC-7721 and HepG2 cells

2.2 CCL7促進SMMC-7721肝癌細胞侵襲和遷移能力通過Transwell實驗分析共培養CCL7對SMMC-7721的侵襲和遷移能力的影響，結果如圖2A～2C所示，CCL7可顯著增強SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力，差異有統計學意義(P<0.05)。使用不同濃度的CCL7與SMMC-7721共培養24、48、72 h，再用CCK-8實驗來檢測細胞增殖效果，結果如圖2D所示、CCL7對SMMC-7721細胞增殖能力呈一定濃度、時間依賴性，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

圖2 SMMC-7721與CCL7共培養對其侵襲、遷移和增殖能力的影響 A：SMMC-7721細胞的遷移能力；B：SMMC-7721細胞的侵

2.3 CCL7 siRNA抑制CCL7表達后抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力CCL7 siRNA通過瞬時轉染抑制SMMC-7721細胞中CCL7的表達，其中包括3個靶點、1個空白對照組、1個陰性對照組。使用qRT-PCR、Western blotting和ELISA方法檢測CCL7 siRNA的干擾效率，確定其中能顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721中CCL7的表達水平為最佳干擾靶點(見圖3A～3D)。與si-NC組相比，si-CCL7組肝癌細胞的侵襲能力和遷移能力明顯受到抑制(見圖3E～3F)。進一步通過相關性分析，肝癌細胞的侵襲能力與CCL7表達量呈正相關，肝癌細胞的遷移和侵襲能力也與CCL7表達量呈正相關(見圖3G～3H)。

圖3 siRNA轉染SMMC-7721后侵襲和遷移能力的影響 A：Western blotting 檢測CCL7 siRNA最佳靶點；B：A的統計學數據；C：qRT-PCR檢測CCL7 siRNA最佳靶點；D：ELISA檢測CCL7 siRNA最佳靶點；E：Transwell遷移實驗分別檢測各組SMMC-7721細胞的遷移能力和侵襲能力；F：E的數據統計；G：CCL7與SMMC-7721遷移性Pearson分析；H：CCL7與SMMC-7721侵襲性Pearson分析

2.4 CCL7促進肝癌細胞上皮-間質轉化(EMT)200 ng/ml CCL7與SMMC-7721共培養72 h，通過用Western blotting實驗來檢測E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist表達量。與對照組相比，CCL7共培養組E-cadherin的表達明顯升高，而Vimentin、Snail、Twist的表達明顯降低(見圖4A～4B)。用CCL7 siRNA最佳靶點轉染SMMC-7721細胞后，細胞中E-cadherin的表達量顯著上升，Vimentin、Snail、Twist的表達量顯著下降(P<0.01)(見圖4C～4D)。

圖4 CCL7對SMMC-7721 EMT相關蛋白表達的影響 A：Western blotting 檢測對照組和CCL7共培養組中E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist的表達量；B：A的統計學數據；C：Western blotting檢測對照組、NC組和si-CCL7組中E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist的表達量；D：C的統計學數據

2.5 肝癌細胞通過ERK/JNK通路調節EMTsiRNA抑制SMMC-7721細胞中CCL7的表達后，細胞中p-ERK、p-JNK的表達量顯著下降(P<0.01)，但ERK、JNK的表達量差異無統計學意義(P=0.674)，p-ERK/ERK和p-JNK/JNK的比值顯著變小(見圖5A～5B)。

JNK/ERK抑制劑20 nmol/L，24 h(UO126)抑制SMMC-7721細胞中ERK/JNK信號通路后，細胞中E-cadherin的表達量顯著上升，Vimentin、Snail的表達量顯著下降(P<0.01)(見圖5C～5D)。

圖5 肝癌細胞通過JNK/ERK通路調節EMT A：Western blotting 檢測對照組、NC組和si-CCL7組中p-ERK、ERK、p-JNK和JNK蛋白水平的表達量；B：A的統計學數據；C：Western blotting 檢測對照組、CCL7組、JNK/ERK通路抑制劑和CCL7+JNK/ERK通路抑制劑組中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平的表達量；D：C的統計學數據

3 討論

HCC作為常見的惡性腫瘤之一，其較高的侵襲能力和遷移能力使患者的預后較差。CCL7也叫MCP-3,是趨化因子CC亞族成員，首次發現于骨肉瘤上清液中[5]。正常情況下，CCL7由成纖維細胞、單核細胞、氣道平滑肌細胞、角質形成細胞等表達。在病理情況下，腫瘤細胞也可表達。CCL7作用于多種靶細胞，如單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷細胞(NK)和活化的T淋巴細胞等，通過與上述靶細胞表面受體結合可以使靶細胞向炎癥組織遷移，參與免疫應答，控制炎癥反應。然而，有研究表明，病灶性牛皮癬[6]、獲得性免疫缺陷綜合征[7]、急性中性粒細胞性肺炎和肺纖維化的惡化[8]與CCL7的異常升高有關。目前在結腸癌[9-10]、結腸癌肝轉移[11]、非小細胞肺癌[12]、腫瘤相關成纖維細胞[13]等研究中發現CCL7與腫瘤的侵襲、遷移相關。在本項研究中我們發現，與正常人肝細胞株相比，CCL7在肝癌細胞SMMC-7721中過表達，這表明CCL7可能在HCC中作為致癌基因發揮作用。

為研究SMMC-7721細胞中CCL7是否影響其侵襲、遷移能力，我們首先使用SMMC-7721細胞與200 ng/ml的CCL7共同培養24 h，通過Transwell實驗我們發現，共培養組與空白對照組相比，SMMC-7721細胞的侵襲、遷移能力明顯增強。之后使用siRNA抑制SMMC-7721細胞中CCL7的表達后再次檢測肝癌細胞的侵襲、遷移能力，結果表明，CCL7的抑制顯著降低SMMC-7721細胞的侵襲、遷移能力，相關性分析表明，SMMC-7721細胞中CCL7的表達量與肝癌細胞的侵襲、遷移能力呈正相關，證實CCL7參與并促進了肝癌細胞的侵襲和遷移過程。

EMT在多種腫瘤的侵襲、遷移中發揮重要作用。目前已經明確E-cadherin、N-cadherin、EMT轉錄因子(EMT-TFs)、Snail、Twist等間質蛋白在EMT中的關鍵作用。本研究顯示，共培養組中CCL7濃度與E-cadherin的表達成反比，與Vimentin、Snail、Twist的表達成正比。用最佳CCL7 siRNA干擾靶點轉染SMMC-7721細胞后再用Western boltting檢測細胞中E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist表達量，結果顯示，用CCL7 siRNA最佳靶點轉染SMMC-7721細胞后，細胞中E-cadherin的表達量顯著上升，Vimentin、Snail、Twist的表達量顯著下降。說明CCL7有可能通過調節EMT來參與肝癌細胞的侵襲和遷移。

趨化因子與其受體結合可以影響腫瘤細胞的血管生成[14]、腫瘤生成、EMT[15-16]。趨化因子及其受體結合將激活各種細胞生物學過程(包括細胞增殖、分化和遷移)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導途徑[17-19]。其中參與腫瘤發生、發展主要為3種：細胞外信號相關激酶(ERK-1/2)、JUN氨基末端激酶(JNK1/2/3)和p38蛋白。近期有研究發現，CCL7可以激活MAPK下游通路[20]，但關于CCL7-MAPK介導的EMT仍不清楚。Western blotting實驗顯示，siRNA抑制SMMC-7721細胞中CCL7的表達后，細胞中p-ERK、p-JNK的表達量顯著下降，但ERK、JNK的表達量未見變化，p-ERK/ERK和p-JNK/JNK的比值顯著變小。結果說明，CCL7在肝癌細胞中可能通過促進ERK/JNK活化來增強ERK/JNK信號通路的作用，而抑制CCL7的表達可以減少ERK/JNK的磷酸化水平。

為了進一步研究CCL7誘導的肝癌細胞侵襲和遷移中ERK/JNK信號通路是否與EMT之間存在關系，我們用特異性ERK/JNK抑制劑UO126抑制SMMC-7721細胞中ERK/JNK信號通路，結果使用UO126抑制SMMC-7721細胞中ERK/JNK信號通路后，細胞中E-cadherin的表達量顯著上升，Vimentin、Snail的表達量顯著下降。此結果與用CCL7 siRNA轉染SMMC-7721細胞后的結果相一致。

綜上所述，我們發現CCL7在SMMC-7721細胞中高表達，且與其侵襲和遷移能力呈正相關。共培養的CCL7可以促進SMMC-7721細胞的侵襲和遷移，而siRNA抑制SMMC-7721細胞中的CCL7可以抑制其侵襲和遷移。進一步研究發現CCL7可能通過誘導ERK/JNK的磷酸化激活ERK/JNK信號通路來影響EMT，從而促進SMMC-7721細胞的侵襲和轉移。