原發性肝癌中CD133和EpCAM蛋白表達與阿帕替尼療效的關系研究

常 健，陳仁旺，楊盛力，胡建莉

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院腫瘤中心，湖北 武漢 430022

原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。2010年中國腫瘤注冊數據顯示，我國肝癌發病率和病死率均躍居全球第一，發病例數約占全球55%，死亡人數占50%，在與腫瘤相關的死亡中僅次于肺癌，居第二位[1]。對于原發性肝癌，手術仍是首選的治療方式，但多數患者發現時已失去手術機會。對于晚期肝癌患者，全身治療(包括化療、靶向治療)、經肝動脈栓塞化學治療(transarterial chemoembolization，TACE)、射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)及中醫藥治療等手段可提高患者的生存率，對改善患者生活質量有一定幫助，但遠期療效仍有待提高[2]。

目前索拉非尼是晚期肝癌患者有效的治療手段，但索拉菲尼只能將晚期肝癌患者的中位生存時間延長3個月。而且價格昂貴，無法從大量的患者中挑選有效人群，限制了其在臨床上的使用[3]。隨著抗血管生成藥物的發展，作用于血管內皮生長因子(VEGF)及血管內皮生長因子受體(VEGFR)信號通路的抗腫瘤藥物越來越受到廣泛關注。其中甲磺酸阿帕替尼(商品名：艾坦)是一種新型口服小分子抗血管生成制劑，可高度選擇性結合并抑制VEGFR-2，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長。雖然目前尚未批準該藥用于除晚期胃癌以外的其他惡性腫瘤的治療，但已在多種實體瘤中開展了臨床研究[4-5]。

Reya等提出腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)理論，腫瘤組織中有少量細胞具有不確定的自我更新、多向分化潛能及產生異質性腫瘤細胞的能力[6]，CSCs的存在是腫瘤復發、轉移、放化療抵抗的重要原因。越來越多的證據表明，肝癌組織中存在一小部分具有CSCs特性的癌細胞，即肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)。近年來LCSCs特異性標志物的鑒定和針對靶向治療的靶點是研究的熱點。目前已經鑒定了幾種LCSCs標志物，包括白細胞分化抗原133(CD133)、CD90、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、CD13、CD47和角蛋白19等[7-11]。

本研究分析甲磺酸阿帕替尼一線治療晚期原發性肝癌患者的無進展生存期(PFS)及肝癌組織干細胞表型特征，并分析可能影響預后的因素，試圖探索一種晚期原發性肝癌一線治療的新的、有明確適應人群的治療手段，造福廣大晚期原發性肝癌患者。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集收集華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院2015年2月至2017年8月經病理確診為Child-Pugh A級的晚期肝細胞癌(HCC)患者33例，均使用一線單藥甲磺酸阿帕替尼治療，未聯合其他抗腫瘤治療。劑量為250～500 mg/d，餐后半小時口服，連續服用，直至出現不可耐受的不良反應或疾病進展。

1.2 免疫組化方法33例肝癌組織標本經常規石蠟包埋，4 μm厚度切片?？贵w分別是抗人CD133(目錄號：ab216323)、CD90(目錄號：ab133350)和EpCAM(目錄號：ab223582)小鼠單克隆抗體，均購自Abcam公司。陽性判斷參考已發表的文獻[12-13]。根據具有陽性細胞質/膜染色的腫瘤細胞的比例，對CD133表達水平進行半定量評分，0分(陰性)：<1%的腫瘤細胞染色；1分：弱染色比例≥1%；2分：中度染色比例≥1%；3分：強染色比例≥1%。染色得分2分和3分被定義為陽性染色，而0分和1分被視為陰性染色[12]。

1.3 隨訪及療效評價隨訪截止時間為2018年3月。用藥后根據患者用藥前后的影像學資料，按照mRECIST標準評定其療效。

1.4 統計學處理采用SPSS 26.0軟件進行統計學處理，數據以中位數(范圍)或絕對頻率(%)表示。計數資料的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床生化資料33例患者中，男31例，女2例，男女比例為15.5∶1.0。發病年齡27～76歲，平均年齡50.4歲?；颊呋九R床特征見表1。33例患者腫瘤組織中CD133、CD90和EpCAM的陽性表達例數分別為16例、17例和17例(見圖1)。

表1 33例肝癌患者臨床特征Tab 1 Clinical characteristics of 33 patients with liver cancer

圖1 肝癌組織中CD133和EpCMA陽性表達的免疫組化結果(SABC，200×) A： CD133陽性表達； B： EpCMA陽性表達Fig 1 Immunohistochemical results of positive expression of CD133 and EpCMA in liver cancer tissues (SABC，200×) A： CD133 positive expression； B： EpCMA positive expression

2.2 分組及相關預后指標將33例患者分為PFS≤3個月組(11例)和PFS>3個月組(22例)，分別與肝癌組織中CD133、CD90和EpCAM的陰性和陽性表達的相關性采用Pearson相關性檢驗，結果顯示，CD133和EpCAM的陽性表達與PFS長短呈負相關(見表2)。

表2 與PFS相關的預測標志物分析Tab 2 Analysis of predictive markers related to PFS

對33例病例進行生存分析，PFS為(2.8±0.3)個月(95%CI：2.24～3.33)。分別以肝癌組織中CD133、CD90和EpCAM的陰性和陽性表達分組進行生存分析，生存曲線顯示，CD133陰性組PFS(3.5±0.4)個月高于陽性組(2.1±0.3)個月(P<0.05)。生存曲線顯示，EpCAM陰性組PFS(3.5±0.3)個月高于陽性組(2.0±0.3)個月(P<0.05)。生存曲線顯示，CD90陰性組PFS與CD90陽性組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見圖2)。提示：腫瘤組織CD133、EpCAM的陰性和陽性表達均可影響患者生存率，對HCC評估預后具有重要的指導價值。

圖2 Kaplan-Meier法分析一線使用甲磺酸阿帕替尼的晚期肝癌患者肝癌組織中CD133、EpCAM、CD90的表達與預后的關系Fig 2 Kaplan-Meier plots for analysis of the relationship between the expressions of CD133, EpCAM, and CD90 in liver cancer tissues and prognosis in patients with advanced liver cancer who used Apatinib mesylate in the first line

肝癌組織中CD133和EpCAM的表達可用于預測甲磺酸阿帕替尼的療效。圖3所示3例患者，分別是CD133、CD90和EpCAM均陰性，CD133陽性，CD133、EpCAM均陽性，甲磺酸阿帕替尼治療3個月后的療效分別是疾病進展(PD)、疾病穩定(SD)和部分緩解(PR)。

注：病例1：CD133、CD90、EpCAM均為陰性；病例2：CD133陽性、CD90和EpCAM陰性；病例3：CD133、EpCAM陽性，CD90陰性。

3 討論

近年來，肝癌的治療已經有了很大的進展，但晚期HCC患者的總體預后仍較差，如果僅給予最佳支持治療，歐美患者的的平均生存時間為6～9個月，而亞洲患者(除日本外)的生存期僅為3～4個月[14-17]。兩項大型、隨機對照的國際多中心臨床試驗SHAPR和Oriental研究結果表明，索拉菲尼能夠延長晚期HCC患者生存時間，因此索拉非尼已獲批得180多個國家和地區藥監部門的批準，用于無法手術或遠處轉移的晚期HCC患者，但由于索拉非尼總體客觀有效率低，生存獲益有限、毒副作用較多、價格昂貴且無有效的療效預測因子，極大地限制了臨床上的廣泛應用，因此，對于晚期HCC患者亟需尋找新的有效治療藥物[18]。

腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉移的關鍵環節之一，腫瘤組織需依賴新生血管提供的氧氣和營養物質來滿足腫瘤細胞不斷擴增的需要，因此對于腫瘤血管的干預能夠有效地抑制腫瘤的生長[19]。甲磺酸阿帕替尼可高度選擇性地結合并抑制VEGFR-2，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長[20-24]。但目前應用的包括索拉菲尼在內的肝癌靶向治療藥物尚無有效的療效預測指標。肝癌干細胞的生物學特征的許多方面已經被揭示。然而，其生物學作用和機制仍有待闡明，基于腫瘤干細胞的肝癌診斷和根除腫瘤干細胞的治療均需進一步研究。肝癌細胞具有多種生物標志物的異質性癌細胞，但治療一般是根據臨床分期選擇的，因此希望能通過各種標志物的組合對患者進行詳細分類，以便提供最佳治療方案。因此，本研究通過回顧性分析近兩年我院腫瘤中心應用甲磺酸阿帕替尼治療晚期一線原發性肝癌的患者資料，尋找到能夠預測其治療療效的腫瘤干細胞分子標志物，為醫師在臨床上選擇合適的患者用藥提供指導，避免無效治療和無謂的經濟損失。

目前報道的索拉菲尼治療晚期原發性肝癌的PFS為3～4個月，本研究的結果顯示，甲磺阿帕替尼聯合最佳支持治療一線治療晚期原發性肝癌的PFS達到(2.8±0.3)個月。進一步分析肝癌組織CD133和EpCAM的陰性陽性表達均可影響患者的疾病進展時間，對HCC評估預后具有重要的指導價值。

本研究將33例取得肝癌組織標本的患者分為PFS≤3個月組和PFS>3個月組，分別與肝癌組織中幾個分子標志物的表達水平進行相關性檢驗，結果提示肝癌組織CD133和EpCAM的陽性表達與PFS長短呈負相關。提示以上因素可能與甲磺酸阿帕替尼治療晚期肝癌療效相關，可以為臨床用藥選擇提供指導。有研究發現，肝癌組織中CD133和EpCAM的表達可能與腫瘤的侵襲、轉移和耐藥性相關，這與本研究的結果相符合[23-24]。因此肝癌組織中CD133和EpCAM的表達水平可用于靶向藥物選擇相關的特定靶點治療和預測標記。在臨床上采用免疫組化這種簡單、廉價、可靠的分析方法檢測這兩種蛋白的表達，從而為臨床選擇用藥提供指導非常有現實意義。本研究為回顧性的、病例數較少，而且治療方式之間存在交叉，同時部分病例隨訪時間較短，需要進一步隨訪后分析。

綜上分析，甲磺阿帕替尼在晚期原發性肝癌患者中具有一定臨床療效，是晚期原發性肝癌患者的一種治療選擇，有一定的療效預測因素。但目前相關臨床研究仍較少，其療效及其預測指標仍需更大規模的臨床研究。期待有更多的數據加以證實。