微囊藻毒素-LR對豬體外成熟卵母細胞氧化損傷與凋亡的影響

石鳳垚,李文慧,趙紅宇,王 陽,莊瑞雪,芮 榮,劇世強

(南京農業大學動物醫學院, 南京 210095)

近年來，因江、河、湖泊等水體富營養化日益加重所導致的藍藻水華(cyanobacteria bloom)頻繁爆發已引起公眾的廣泛關注，尤其是由富營養化水體中藍藻所產生的次生代謝產物-微囊藻毒素(microcystins, MCs)，分布范圍廣，結構穩定，且毒性作用強，可對動物及人類健康造成嚴重威脅[1-4]。MCs極易溶于水，耐熱且化學性質穩定，現有手段很難將其從飲用水源中去除[5]。MCs可通過受污染的飲用水、水產品、農作物及飼料等途徑進入動物機體，并通過食物鏈累積效應使動物機體積累更高濃度的MCs，對機體肝、腎、生殖、神經等組織器官產生毒性作用[6-8]。在目前已知的200多種MCs異構體中[4]，微囊藻毒素-LR (MC-LR)是分布最廣，且毒性作用最強的一種微囊藻毒素[9-11]。已有研究表明，MC-LR對動物肝、腎等多種組織器官均具有明顯的毒性損傷作用[12-15]。

近年來研究發現，動物性腺也是MC-LR重要的靶器官之一[13,16]，MC-LR不僅可以在肝、腎等多種組織中積聚，也會在動物的性腺中積累，并產生毒性損傷，影響動物的生殖功能[17-20]。研究表明，長期接觸MC-LR會導致雄性小鼠精子數量減少、活力降低，并使血清睪酮水平明顯下降[21]；可引起大鼠睪丸間質細胞活性氧(ROS)激增，致使細胞發生凋亡[22]。在對雌性動物的研究中發現，MC-LR可導致小鼠卵巢內高質量卵泡數量減少、血清激素水平紊亂，并導致發情周期異常[23]；還可使中國倉鼠卵巢顆粒細胞發生氧化應激，破壞細胞骨架，致使細胞周期阻滯，并最終誘導細胞凋亡[24-25]。這些結果初步揭示了MC-LR對動物生殖也具有潛在的毒性作用。

本試驗以體外成熟培養的豬卵母細胞為研究對象，通過免疫熒光結合激光共聚焦成像等技術分析不同濃度MC-LR對豬卵母細胞成熟過程中細胞骨架、氧化應激以及早期凋亡的影響，探究MC-LR對動物卵母細胞的毒性損傷作用，為后續進一步研究MC-LR的生殖毒性作用及其機制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

微囊藻毒素-LR (MC-LR)購自普瑞邦生物工程有限公司；TCM 199購自Gibico公司；鼠抗α-tubulin-FITC單克隆抗體購自Sigma-Aldrich公司；活性氧(ROS)試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒購自南京建成生物有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、TB Green?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司。其他試劑若無特殊標注均為Sigma-Aldrich公司產品。

1.2 豬卵母細胞培養與處理

豬卵巢樣品購自南京元潤食品有限公司屠宰場，置于37 ℃生理鹽水中，2 h內運至實驗室。選取卵巢上直徑約為3～6 mm的卵泡，抽取其中的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes, COCs)，在體視顯微鏡下挑撿胞質均勻、且包被3層以上卵丘細胞的COCs。根據試驗設計，將所收集的COCs隨機分為4組，分別置于已添加不同濃度MC-LR (0、20、40和60 μg·mL-1)的TCM199培養液中進行體外成熟培養。在體外成熟培養44 h后收集COCs，經0.1%透明質酸酶消化，去除卵丘細胞后，分別進行第一極體(first polar body，PbⅠ)鏡檢、免疫熒光染色及RT-qPCR等檢測。

1.3 間接免疫熒光染色

將所收集的卵母細胞樣品，用4%多聚甲醛室溫固定1 h后轉入1% 的TritonX-100中于飽和濕度的濕盒中室溫通透8 h，再用1%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)于濕盒中室溫封閉1 h， 之后與異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的抗α-tubulin-FITC抗體(1∶200)在室溫孵育2 h，最后用10 μg·mL-1的Hoechst33342避光染色15 min后進行封片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下進行觀察分析。

1.4 卵母細胞內ROS水平檢測

試驗前用TCM 199成熟培養液將DCFH-DA稀釋成10 μmol·L-1工作液，置于培養箱中平衡30 min。 將去除卵丘細胞的卵母細胞移入PBS中清洗3次后置于工作液中，于培養箱中避光孵育30 min。 孵育完成并經PBS清洗3次后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

1.5 卵母細胞內谷胱甘肽含量測定

將去除卵丘細胞的卵母細胞移入PBS中洗3次，再移入含1 mL PBS的離心管中，按照谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒說明書介紹的方法對各組卵母細胞GSH-Px酶活力進行測定。

1.6 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測

將去除卵丘細胞的卵母細胞移入PBS中清洗3次， 按照Annexin V-FITC凋亡檢測盒說明書介紹的方法，將卵母細胞置于含5% Annexin-V-FITC的PBS緩沖液中，在37 ℃培養箱避光孵育10 min，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察分析。

1.7 氧化應激和凋亡相關基因RT-qPCR測定

每組收集100枚卵母細胞樣品，按 Trizol 試劑盒說明書提取細胞總RNA。用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，-80 ℃保存備用。按照TB Green qPCR試劑盒說明書檢測 mRNA 的表達水平，反應產物經熔解曲線檢測特異性。用 2-ΔΔCT法計算各基因mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences used for real-time PCR

1.8 統計分析

2 結 果

2.1 MC-LR對豬卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞成熟培養液中添加不同濃度MC-LR(0、20、40、60 μg·mL-1)對豬卵母細胞PbⅠ排出影響的試驗結果見圖1。隨著MC-LR毒素濃度增加，卵母細胞PbⅠ排出率呈明顯的下降趨勢，并具有劑量依賴性。與對照組(73.20%)相比，20 μg·mL-1MC-LR試驗組的PbⅠ排出率(69.59%)略有下降，并無顯著差異(P>0.05)；當MC-LR作用濃度分別達到40 和60 μg·mL-1時，卵母細胞PbⅠ排出率分別極顯著下降至59.96% (P<0.01)與51.64% (P<0.001)。 這一研究結果表明，當MC-LR作用濃度達到40 μg·mL-1及以上時，豬卵母細胞PbⅠ排出受到極顯著抑制，導致卵母細胞成熟進程受阻。

A. MC-LR處理導致豬卵母細胞第一極體(PbⅠ)排出失敗; B. MC-LR處理導致卵母細胞PbⅠ排出率顯著下降：n表示卵母細胞樣本數。**.P<0.01, ***.P<0.001。下圖同A. Oocytes failed to extrude the first polar bodies (PbI) after MC-LR treatment; B. The PbI extrusion rate was significantly reduced after MC-LR treatment: n. Sample number. **. P<0.01, ***. P<0.001. The same as below圖1 MC-LR對豬卵母細胞體外成熟的影響Fig.1 Effect of MC-LR on the maturation in vitro of porcine oocytes

2.2 MC-LR對豬卵母細胞紡錘體結構的影響

為探究MC-LR抑制豬卵母細胞PbⅠ排出的原因，本研究采用間接免疫熒光染色與激光共聚焦成像技術檢查并分析了MC-LR(60 μg·mL-1)處理后卵母細胞紡錘體及染色體的形態結構與動態分布的變化情況。由圖2A可見，經44 h體外成熟培養，對照組卵母細胞的微管蛋白α-tubulin組裝成典型的紡錘體結構，且染色體整齊排列在赤道板上；而處理組卵母細胞的微管蛋白α-tubulin分布紊亂，紡錘體結構異常，染色體也隨之無規律排列。由圖2B可見，與對照組(25.13%)相比，MC-LR處理組的紡錘體異常率極顯著升高(62.52%，P<0.001)。這一結果提示，MC-LR對豬卵母細胞的紡錘體結構具有明顯的毒性損傷作用。

A. MC-LR處理導致豬卵母細胞紡錘體結構異常(綠色:紡錘體; 藍色:染色體); B. MC-LR處理導致卵母細胞錘體結構異常率顯著升高A. MC-LR treatment resulted in abnormal spindle structure of porcine oocytes (Green: Spindle; Blue: Chromosome); B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in spindle structure abnormality rate of porcine oocytes圖2 MC-LR對豬卵母細胞紡錘體結構的影響Fig.2 Effect of MC-LR treatment on the spindle structure of porcine oocytes

2.3 MC-LR誘導豬卵母細胞氧化應激的檢測

為進一步研究MC-LR處理導致豬卵母細胞成熟失敗的原因，利用熒光探針DCFH-DA檢測了MC-LR (60 μg·mL-1)處理后卵母細胞ROS水平的變化情況，結果見圖3。MC-LR處理組卵母細胞的ROS平均熒光強度極顯著高于對照組(P<0.01)。

A.MC-LR 處理導致卵母細胞ROS水平升高；B．MC-LR 處理導致卵母細胞ROS平均熒光強度顯著升高A.MC-LR treatment resulted in higher ROS levels in oocytes; B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in the average fluorescence intensity of ROS in oocytes圖3 MC-LR對豬卵母細胞ROS水平的影響Fig.3 Effect of MC-LR treatment on ROS levels in porcine oocytes

在檢測卵母細胞ROS水平基礎上，為進一步研究MC-LR處理對豬卵母細胞氧化應激的影響，檢測分析了MC-LR作用對卵母細胞GSH-Px活力及抗氧化相關基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達的影響，結果如圖4A所示，MC-LR處理組卵母細胞GSH-Px活力極顯著降低(P<0.01)；從圖4B可知，MC-LR處理組卵母細胞，除SOD2無明顯變化外，SOD1、CAT和GSH-Px的mRNA水平均極顯著下降(P<0.01)。說明，MC-LR處理導致豬卵母細胞在體外成熟過程中產生了明顯的氧化應激，且卵母細胞的抗氧化能力顯著下降。

A.MC-LR處理導致卵母細胞GSH-Px活力顯著降低；B．MC-LR處理對卵母細胞氧化應激相關基因表達的影響A.MC-LR treatment resulted in lower GSH-Px levels in oocytes; B. Effect of MC-LR treatment on the expression of oxidative stress related genes in oocytes圖4 MC-LR對豬卵母細胞GSH-Px活力及抗氧化相關基因表達的影響Fig.4 Effect of MC-LR treatment on GSH-Px activity and mRNA expression of oxidative stress related genes in porcine oocytes

2.4 MC-LR引發豬卵母細胞凋亡的檢測

因氧化應激與細胞凋亡密切相關，在檢測卵母細胞氧化應激的基礎上，進一步通過Annexin-V染色檢測MC-LR(60 μg·mL-1)處理后卵母細胞早期凋亡情況，結果如圖5所示，與對照組相比，MC-LR 處理后卵母細胞發生早期凋亡的細胞比率從28.53%極顯著升高至59.35%(P<0.01)。

A.MC-LR 處理誘導了卵母細胞早期凋亡；B.MC-LR 處理導致卵母細胞凋亡率顯著升高A.MC-LR treatment induced the early apoptosis of oocytes; B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in the apoptosis rate of oocytes圖5 MC-LR對豬卵母細胞早期凋亡的影響Fig.5 Effect of MC-LR treatment on the early-stage apoptosis of porcine oocytes

為進一步研究MC-LR處理對豬卵母細胞凋亡的影響，應用RT-qPCR技術分析了MC-LR處理后卵母細胞凋亡相關基因Bax和Bcl2 的mRNA表達，結果如圖6所示，MC-LR處理后，BaxmRNA表達顯著上調(P<0.05)，Bcl2 mRNA的表達極顯著下調(P<0.001)，Bax/Bcl2的比值極顯著升高(P<0.001)。

圖6 MC-LR對豬卵母細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響Fig.6 Effect of MC-LR treatment on the mRNA expression of early apoptosis related genes in porcine oocytes

3 討 論

MC-LR是所有微囊藻毒素中毒性最強的一類環狀七肽，其結構穩定，分布廣泛，可通過飲用水或受污染的食物進入動物體內，對多種組織器官產生毒性作用。已有研究表明，MC-LR可在卵巢中積累并產生生殖毒性[23]，誘導顆粒細胞氧化應激，促進卵泡閉鎖，致使小鼠不育[24-25]。MC-LR甚至還可以通過胎盤屏障影響胎兒肝、腎及大腦等組織器官的形成和發育[26-28]。這些結果表明，MC-LR對雌性動物的生殖發育具有潛在的毒性作用，但MC-LR是否會對哺乳動物卵母細胞產生毒性作用目前尚不明確。本研究以體外成熟培養的豬卵母細胞為研究模型，探討了不同濃度MC-LR對豬卵母細胞的毒性損傷作用，結果表明，MC-LR可顯著抑制豬卵母細胞成熟，其毒性作用機制與誘導紡錘體結構損傷、引發氧化應激與早期細胞凋亡密切相關。

本研究首先發現，MC-LR對豬卵母細胞體外成熟具有明顯的抑制作用，并具有劑量依賴性，當以40 μg·mL-1以上MC-LR處理豬卵母細胞時，其第一極體排出率會顯著下降。在動物卵母細胞減數分裂過程中，紡錘體的正確組裝與動態分布對于染色體的精確分離與極體的順利排出等生物學事件起著至關重要的作用[29]。因此，本研究進一步通過激光共聚焦掃描技術對卵母細胞的紡錘體等亞細胞結構進行了分析，結果發現，MC-LR作用后卵母細胞的紡錘體結構發生嚴重缺陷，并伴隨同源染色體分離的異常，導致卵母細胞第一極體排出失敗。這一結果提示，MC-LR對豬卵母細胞的紡錘體結構具有明顯的毒性損傷作用。已有的研究結果也證實，MC-LR可對其他多種細胞模型的細胞骨架結構造成損傷[30-31]，Frange?等[32]在兔胚胎的研究中發現，用10 μmol·L-1的MC-LR處理胚胎細胞24 h，即可導致細胞的紡錘體微管在細胞核周圍發生塌陷并重組，Chen等[33]以雄性大鼠為研究模型，進一步從基因轉錄水平研究發現，MC-LR可破壞睪丸組織細胞骨架相關基因轉錄的穩定性。這些研究結果表明，MC-LR可通過破壞細胞的紡錘體微管系統對細胞產生毒性損傷。在本研究中，MC-LR使卵母細胞紡錘體結構產生損傷，進而影響了同源染色體精確分離，最終導致卵母細胞第一極體無法排出。

已有研究表明，MC-LR的毒性作用機制主要是通過產生過量的ROS來誘導氧化應激，導致細胞功能障礙，引發細胞凋亡[34-35]。哺乳動物的卵母細胞和胚胎對ROS十分敏感，在卵母細胞減數分裂、胚胎發育及細胞死亡等生理過程中，ROS發揮著至關重要的作用，它和抗氧化劑之間的動態平衡確保了卵母細胞及胚胎正常發育[36-37]。為進一步驗證MC-LR對豬卵母細胞的毒性作用機制是否與氧化損傷有關，本研究對MC-LR處理后卵母細胞的ROS水平及抗氧化相關基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-Px的表達進行了檢測分析，結果發現，卵母細胞的ROS水平顯著增加，提示MC-LR處理導致卵母細胞發生了明顯的氧化應激反應，與此同時，部分抗氧化酶基因(SOD1、CAT和GSH-Px)表達水平也明顯下調，進一步說明MC-LR作用44 h后，卵母細胞的抗氧化能力已顯著下降。因此推測，MC-LR誘導豬卵母細胞發生氧化應激，并破壞了細胞內抗氧化防御系統的平衡，導致卵母細胞發生氧化損傷。細胞的氧化損傷與凋亡密切相關，高水平的ROS會通過改變線粒體通透性破壞線粒體動力學，引起線粒體功能障礙，導致由線粒體介導的細胞凋亡[38-41]。本試驗通過Annexin-V染色發現，經MC-LR處理的卵母細胞早期凋亡率顯著增加，RT-qPCR結果也顯示，凋亡相關基因Bax轉錄水平上調，Bcl2轉錄水平下調，Bax/Bcl2比值顯著升高。因此推測，MC-LR通過誘導豬卵母細胞氧化應激，進一步導致細胞發生早期凋亡。

4 結 論

本研究結果證明，MC-LR對豬卵母細胞的紡錘體結構具有明顯的損傷作用，致使第一極體無法排出，最終導致卵母細胞成熟失??；MC-LR對豬卵母細胞的毒性損傷作用機制與誘導氧化損傷及細胞凋亡密切相關。本研究結果為深入探討MC-LR對哺乳動物卵母細胞的毒性作用及其機制提供了試驗依據。