腫瘤組織中細胞間粘附分子-1表達的PET/近紅外熒光跨模態靶向成像表征

李 淼，BARNHART Todd E，ENGLE Jonathan W

1西安交通大學第一附屬醫院醫學影像科，陜西 西安710061；2威斯康星大學麥迪遜分校醫學物理系，美國麥迪遜53705

細胞間粘附分子-1（ICAM-1）是一種跨膜糖蛋白，可介導腫瘤細胞與內皮細胞、胞外基質之間的識別和粘附，促進腫瘤血管生成和腫瘤轉移［1-2］。ICAM-1的生理性表達水平較低，在乳腺癌、甲狀腺癌組織中已被證實高表達?；诖吮磉_差異的臨床前靶向成像研究已見報道［3-4］。有報道稱，胰腺癌組織相對于正?；蛞认傺捉M織也高表達ICAM-1［5-6］。胰腺癌是一種預后較差的惡性腫瘤。其早期癥狀隱匿，確診時分級普遍偏高，病死率接近發病率［7-8］。由于手術是胰腺癌唯一可能的根治手段，而術后常見病灶殘留及轉移［9］，故準確定位病灶顯得尤為重要［10］。臨床上常用于檢測胰腺癌的血清學標志物（糖抗原CA19-9、癌胚抗原CEA等），其靈敏度雖高，但無法給出病灶的解剖定位［11-13］；傳統影像學手段雖能反映解剖定位，但只能給出物理信息，難以描述細微生物學改變，組織特異性不足［9］。已知分子影像學方法可選擇性、全身、無創、實時監測。但臨床常用于胰腺癌的葡萄糖代謝類、乏氧靶向類傳統分子影像示蹤劑屬于小分子化合物、配體或底物，其靶組織特異性或濃聚程度尚不理想［14］。胰腺癌組織高表達ICAM-1，提示針對ICAM-1進行胰腺癌靶向成像或治療不僅具有潛在臨床價值，也具有可行性［6,15］。為克服前述傳統示蹤劑的不足，本研究擬基于具備高度特異性和親和力的、針對ICAM-1的單克隆抗體（簡稱單抗）構建靶向示蹤劑［16］。通過在單一靶向分子上標記熒光團/核素雙標簽制備示蹤劑，分別用于近紅外熒光（NIRF）和正電子發射斷層（PET），以期獲得較好的靶/非靶組織成像對比度。本研究提出采用跨模態對照成像表征胰腺癌組織中ICAM-1的表達情況這一新策略，旨在為腫瘤病灶的術前全身無創定位，以及為后續術中導航等臨床應用提供有價值的跨模態融合成像技術路線，以期有助于改善治療決策或患者預后。

1 材料與方法

1.1 試劑

小鼠抗人ICAM 1 單抗（克隆號R6-5-D6；BioXCell）；1-（4-異硫氰酸苯基）-3-[6,17-二羥基-7,10,18,21-四氧-27-（N-乙酰羥胺）-6,11,17,22-四氮雜七烷二酮]硫脲，即p-SCN-去鐵胺（Df）；NIRF染料800 CW-N-羥基琥珀酰亞胺基酯（800 CW-NHS）；AlexaFluor488標記山羊抗小鼠抗體（BioLegend）；Pharmingen大鼠抗小鼠CD31抗體（BD）；Cy3標記驢抗大鼠抗體（Jackson Immuno Research）；非特異性人源IgG 對照品（Invitrogen）；PD-10脫鹽柱（GE醫療）；超濾膜（相對分子 質 量 閾 值30 000；Life Technologies）；基 質 膠（Gemini Bio-products）；超純濃鹽酸（Mallinckrodt）；溶于Vectashield介質的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和其他試劑（ThermoFisher公司）。

1.2 熒光團和配合體耦聯

通過抗體賴氨酸殘基上的氨基分別與Df上的異硫氰酸酯基、800 CW-NHS 上的酯基進行耦聯反應，以及通過放射性配位反應，來制備雙標記ICAM-1單抗示蹤劑。將Df 的二甲基亞砜溶液（10 μL）加入ICAM-1 單抗的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）1×/碳酸（氫）鈉緩沖液（0.1 moL,pH 9.2）混合液（體積比1∶1，合計300 μL），Df與ICAM-1單抗的摩爾比為10∶1；室溫振蕩反應2 h；以PBS 1×為流動相，過PD-10柱純化出Df-ICAM-1單抗產物，超濾（13 000×g）濃縮至500 μL；將5 μg 800 CW-NHS溶于無水二甲基亞砜（100 μL）制備儲備液；將800 CW-NHS儲備液和Df-ICAM-1單抗溶液（3 mg/mL，50 μL）加入PBS 1×/碳酸（氫）鈉緩沖液的混合液（體積比1∶1，合計300 μL）；Df-ICAM-1單抗與800 CW-NHS的摩爾比為1∶2，室溫避光振蕩反應2 h；過PD-10柱純化出產物800 CW/Df-ICAM-1單抗，超濾濃縮至150 μL。

1.3 核素制備

[89Zr]鋯采用PETtrace回旋加速器（GE）通過核反應89Y（p,n）89Zr制備。采用能量為16.4 MeV、強度5 mA的質子束流轟擊[89Y]釔箔（厚度250 μm，純度99.9%）2 h；將[89Y]釔箔溶于超純濃鹽酸，溶解液載入羥胺酸修飾樹脂色譜柱；6 N鹽酸淋洗，產物[89Zr]鋯離子采用1 M草酸洗脫，收集草酸[89Zr]鋯餾分。

1.4 核素標記

草酸[89Zr]鋯溶于HEPES緩沖液（500 μL,0.5 moL,pH 7.0），用1 mol/L碳酸鈉溶液調節pH值至7.0～7.5；將800 CW/Df-ICAM-1單抗加入反應體系（100 μg/mCi）；37 ℃下恒溫震蕩（700 r/min）反應1 h；過PD-10柱純化出800 CW/89Zr-Df-ICAM-1單抗（簡稱示蹤劑）餾分，過0.22 μm濾膜除菌。

1.5 細胞培養

人源胰腺癌細胞系（BxPC-3、MIA PaCa）用RPMI 1640培養基（含高糖、10%胎牛血清），通入5%CO2氣體，加濕，37 ℃恒溫培養。當細胞鋪滿培養瓶底80%的面積時，消化收集用于后續測定和接種。

1.6 流式細胞術測定

BxPC-3、MIA PaCa細胞系的ICAM-1表達，采用流式細胞術（簡稱流式）測定。將細胞懸浮于預冷流式緩沖液均分成多管（約1.5×106個細胞/管）；封閉后分別與預冷PBS 1×（作空白對照）、山羊抗小鼠抗體（作二抗對照，終濃度5 μg/mL）、ICAM-1 單抗和800 CW/Df-ICAM-1單抗（分別作一抗，終濃度均為5 μg/mL）在冰上孵育1 h；被ICAM-1單抗和800 CW/Df-ICAM-1單抗染色的細胞用預冷PBS 1×洗滌后，與山羊抗小鼠抗體（終濃度5 μg/mL）在冰上避光反應1 h；每個樣品里的細胞分別重懸于預冷PBS 1×（300 μL），采用LSR Fortessa流式細胞儀（BD）測定。數據采用FlowJo軟件分析。

1.7 皮下異種移植瘤小鼠模型構建

所有動物操作符合當地官方和所在單位的動物倫理規范。動物模型全部采用4～5周齡雌性無胸腺裸鼠（Envigo）構建。接種前將細胞重懸于預冷PBS 1×并與基質膠混合（體積比1∶1），置于冰上暫存；細胞懸液注射于右后肢皮下（5×106細胞/只）。腫瘤直徑達到5～10 mm時用于活體研究。

1.8 活體PET/NIRF成像和離體放射性生物分布

給模型鼠經尾靜脈注射5～10 MBq（0.14～0.27 mCi）示蹤劑后，在預設時點（4、24、48、72、96、120 h）相繼進行跨模態成像。采用Inveon 小動物PET/CT 掃描儀（Siemens）進行PET成像：模型鼠取俯臥位置于PET掃描床上；5～15 min 靜態模式采集，無衰減/散射校正；OSEM3D算法重建；各器官感興趣區（ROI）在Inveon Research Workstation（Siemens）軟件上手動勾劃；ROI定量攝取值記錄為%ID/g。在腫瘤PET ROI攝取值達峰時點，模型鼠完成PET 掃描后，立即移入IVIS Spectrum 成像儀（PerkinElmer）進行NIRF 成像：取俯臥位以更好暴露病灶位置；NIRF 激發/發射波長為745 nm/800 nm；其他參數為IVIS系統默認值。

NIRF成像后立即處死小鼠并解剖。采集血液、主要器官和腫瘤組織，稱重；各組織樣本放射性計數用Wizard 2480 γ計數器（PerkinElmer）測定，換算為%ID/g值。

1.9 組織器官離體NIRF成像

另取BxPC-3 模型鼠注射示蹤劑。在腫瘤PET ROI攝取值達峰時點，將模型鼠窒息處死，取俯臥位，立即進行全身白光明場照相和NIRF成像；剖開右后肢皮膚，暴露瘤體；切除腫瘤前后，再分別進行全身及瘤體的白光明場照相和NIRF成像，參數同上一節。

1.10 免疫組織化學

瘤塊采集后立即冷凍切片（厚度5 μm）；浸入預冷丙酮中固定10 min；室溫放置3 min 風干；室溫封閉30 min 后，切片與作為一抗的ICAM-1 單抗（終濃度10 μg/mL）在4 ℃共孵育過夜；切片與作為二抗的AlexaFluor488標記山羊抗小鼠抗體（終濃度5 μg/mL）在室溫共孵育1 h；取毗鄰切片與作為一抗的大鼠抗小鼠CD31 抗體（終濃度10 μg/mL）在4 ℃孵育過夜，然后切片與作為二抗的Cy3標記驢抗大鼠抗體（終濃度5 μg/mL）在室溫孵育1 h；所有切片滴加DAPI浸潤后加載蓋玻片封片。在A1R共聚焦顯微鏡（Nikon）上觀察。

1.11 統計學分析

定量資料以均數±標準差表示，均值的比較采用Student's t-檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌細胞系ICAM-1表達

BxPC-3與MIA PaCa細胞系的ICAM-1表達水平有顯著差異，前者表達水平更高（圖1）。經800 CW-和Df-基團修飾的ICAM-1單抗（即800 CW/Df-ICAM-1單抗）作一抗時，在上述2種細胞系中表現出來的熒光信號強度，與采用ICAM-1單抗作一抗時相似。

圖1 流式細胞術測定的胰腺癌細胞系細胞間粘附分子-1（ICAM-1）表達Fig.1 Expression of ICAM-1 in pancreatic cancer cell lines detected by flow cytometry.

2.2 熒光團耦聯及核素標記產物

在800CW-NHS 與Df-ICAM-1 單抗的耦聯反應中，本研究選用了已經過驗證的單抗-熒光團分子投料摩爾比（1∶2），以避免熒光團在單抗分子上耦聯過于密集誘發自淬滅現象［17］。示蹤劑終產物比活度為9.8±1.4 mCi（362.69±51.8 MBq/mg，n=6），未經衰減校正的[89Zr]鋯標記反應放射化學產率＞70%。

2.3 活體PET/NIRF成像和離體放射性生物分布

PET成像結果（圖2）顯示，在BxPC-3模型鼠中的腫瘤攝取值在示蹤劑注射后24 h達峰（10.9±2.0%ID/g），之后隨時間推移緩慢下降。在MIA PaCa模型鼠中，示蹤劑注射后，腫瘤攝取值緩慢上升，在24 h到達平臺期5.5±1.0%ID/g，并從96 h開始輕微下降?？梢娫跀z取值峰值上，BxPC-3 腫瘤顯著高于MIA PaCa 腫瘤（P＜0.05）。2種模型鼠的其他器官，攝取值動力學曲線走勢相似，其中肝、脾都有較高生理性攝取。離體放射性生物分布研究顯示，示蹤劑注射后120 h的生物分布攝取值與PET ROI攝取值基本一致（圖3）。2種模型鼠在示蹤劑注射24 h后的典型PET和NIRF對比成像中（圖4）。

縱軸為每克組織注射劑量占比（%ID/g）；橫軸為示蹤劑注射后時點；A：BxPC-3組（n=3）；B：MIA PaCa組（n=4）；P＜0.05。

2.4 組織器官離體NIRF成像

組織器官離體NIRF成像研究結果示，解剖及瘤體切除前后，BxPC-3移植瘤體的位置和邊界在白光明場視圖和NIRF視圖之間能準確匹配（圖5）。瘤體移除后，NIRF信號從接種位點完全轉移到瘤體，原接種位點幾乎無殘留信號。

2.5 免疫組織化學研究

熒光共聚焦顯微成像顯示（圖6），BxPC-3腫瘤組織有強ICAM-1信號，而MIA PaCa腫瘤組織的ICAM-1信號弱。ICAM-1信號與腫瘤細胞周圍位置重疊，與細胞核（DAPI）或血管（CD31）信號未見重疊。CD31信號分布在2種腫瘤組織中大致相當。

圖2 胰腺癌模型鼠正電子發射斷層成像感興趣區攝取值動力學曲線Fig.2 Uptake kinetics of region of interest(ROI)in positron emission tomography (PET) images of mouse models of pancreatic cancer.

圖3 示蹤劑在胰腺癌模型鼠各組織器官的放射性生物分布（BxPC-3和MIAPaCa）Fig.3 Radioactive bio-distribution of the tracer in tumors and major organs of mouse models of pancreatic cancer (BxPC-3 and MIAPaCa).

3 討論

ICAM-1可被視為經典胰腺癌成像靶標（整合素αvβ6、CEA、CA19-9等）之外的新型靶標［14,18-20］。已有報道將拉曼光成像、超聲成像、磁共振成像和單光子發射斷層成像（SPECT）用于胰腺癌ICAM-1成像。盡管這些模態肯定了ICAM-1用作胰腺癌成像靶標的可行性，但其靈敏度和定量能力無法媲美本文所采用的PET［3,21-24］。不論在PET還是NIRF模態，本文中的BxPC-3腫瘤與MIA PaCa腫瘤都顯示出強烈視覺差異。免疫組織化學染色結果也確認，不同胰腺癌組織中ICAM-1的表達差異與前述PET/NIRF 成像和生物分布研究結果相吻合。這說明本文所構建的示蹤劑，針對胰腺癌組織具有優越的體內靶向性和靶組織親和力，本文所采用的PET/NIRF跨模態成像策略具備優良性能。

光學成像是最適合術中導航的模態［25］，尤其是NIRF（700～900 nm），原因包括：（1）避開生物分子吸收光譜，背景干凈；（2）可見光譜內的組織自發熒光比常規染料熒光團低；（3）相比其他波長的光，組織穿透性更好；（4）商品化試劑和成像儀器成本低，無電離輻射，臨床轉化潛力大；（5）空間/時間分辨率、靈敏度較其他光學模態好［26］。本文的組織器官離體NIRF成像時，在各類組織中可見腫瘤信號最強，與胰腺、脾臟組織視覺對比明顯，說明背景組織信號不會干擾腫瘤邊界辨識，證實了本文所構建的示蹤劑在顯示胰腺癌病灶和引導徹底切除腫瘤組織方面的效能。除胰腺癌外，ICAM-1也可作為卒中和動脈粥樣硬化的NIRF成像靶標［27］，其解剖位置較易區分，理論上不影響對胰腺癌的成像。已知NIRF是應用于胰腺癌的雙模態成像共同選用的光學模態［28-31］。由此可知，本文所采用的NIRF的確是最適用于胰腺癌ICAM-1成像的次級模態。

胰腺癌多模態成像的可行性已被涉及其他靶標或模態的多項研究所證實［28-31］，其優勢在于：可交叉驗證病灶定位；可引導內窺鏡成像或穿刺；可在術中輔助確定腫瘤組織邊界［19］。本文提出的跨模態成像策略，對同一單抗分子的雙標記策略，可從信源層面進行模態間解剖定位配準；且相對于分別評價具有不同標記而靶向基團相同的兩種示蹤劑，本文直接評價雙標記示蹤劑可減少工作量。

在生物活性方面，800 CW/Df-ICAM-1單抗作一抗時，前述2種細胞系表現出的熒光信號強度與ICAM-1單抗作一抗時相似，說明本文所采用的熒光團和配合體耦聯修飾方法并未顯著減弱ICAM-1單抗的親和力。在化學穩定性方面，活體PET成像、組織器官離體NIRF成像中均未見骨攝取，說明在前述示蹤劑分子中[89Zr]鋯與Df形成穩定配合物，未見體內脫標；在組織器官離體NIRF成像中，肝攝取不如腫瘤明顯，說明疏水性熒光團脫落很少；以上現象都說明本文所構建的新型示蹤劑穩定性良好。

圖4 胰腺癌模型鼠跨模態成像的典型圖像Fig.4 Typical intermodal images of mouse models of pancreatic cancer.

圖5 BxPC-3胰腺癌模型鼠組織器官原位離體近紅外熒光成像的典型圖像Fig.5 In situ ex vivo near-infrared fluorescent imaging of typical BxPC-3 mouse model of pancreatic cancer.

本文局限之處在于：（1）采用異種移植瘤模型，故小鼠抗人單抗示蹤劑可能并不能反映小鼠的生理性ICAM-1表達；（2）示蹤劑在肝、脾都持續高攝取，可能是由于內皮網狀系統對抗體的典型非特異性吸附-消除作用；（3）定植于細胞表面的膜型ICAM-1，其胞外結構域可被蛋白酶水解脫落，形成配體結合能力相當的可溶型散播到血液中［9,13］，可能消耗部分示蹤劑，干擾對腫瘤的靶向性。為抵償此損失，本文提高了示蹤劑注射劑量。故脾中高攝取可能是因為疏水性800 CW熒光團介導上述示蹤劑分子自聚集［28］；（4）本例采用了裸鼠皮下移植瘤模型。而基因工程或病理組織原位移植瘤模型，將能更好地模擬示蹤劑與腫瘤微環境間的相互作用。

綜上所述，本文報道了以ICAM-1為標志物，基于NIRF熒光團/[89Zr]鋯核素雙標記單抗示蹤劑，對胰腺癌組織進行臨床前靶向PET/NIRF 跨模態成像是可行的。這為同時實現腫瘤活體全身成像和腫瘤組織ICAM-1的原位可視化提供了例證?；贗CAM-1靶向成像進行病灶檢測、手術導航、患者分層和預后評估，有望幫助實現更好的腫瘤精準診療實踐。

圖6 胰腺癌移植瘤切片經免疫組織化學染色后的熒光共聚焦顯微成像Fig.6 Confocal imaging of tissue sections from implanted tumors after immuno-fluorescent staining.Scale bar:100 μm.