凍融胚胎移植時間與子宮內膜轉化時間對妊娠結局的影響

王余江，樊 琳，梁嘉穎，黃 莉，陳創奇，劉 頓，劉風華，張曦倩

(廣東省婦幼保健院生殖醫學中心，廣州 511442)

自1983年冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)技術應用到輔助生殖領域，不僅顯著提高了累積臨床妊娠率，也有效地預防了卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS)風險的發生，同時促進了胚胎植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)和卵子冷凍等衍生技術的發展[1-2]。FET技術的優勢日益突顯，在臨床上得到廣泛應用，在全胚冷凍日趨升高的形勢下，改善FET臨床結局的意義重大[3]。成功植入與妊娠不僅需要具有發育潛能的整倍體胚胎，也需要同步發育的子宮內膜[4-5]。多數學者認為，FET周期將第3日(day 3，D3)胚胎移植到黃體酮補充3天的子宮內，可獲得較穩定的臨床妊娠率[6-8]。然而，在臨床中總有一些不可避免的因素導致移入宮腔內的胚胎與子宮內膜發育不完全一致。因此，明確胚胎與孕酮作用內膜時間的關系，選擇最佳的胚胎移植時機尤為重要。本研究選取FET周期激素替代方案(hormone replacement therapy，HRT)，系統性分析不同孕酮作用內膜時間與移植胚胎的臨床結局，為臨床選擇最佳移植時機提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧分析2013年8月至2016年1月在廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科行HRT-FET周期的1609例患者的臨床結局。納入標準：年齡22～38歲；激素替代周期；首次行FET周期。排除標準：異常子宮；經期孕酮大于1.0ng/ml；輸卵管積水；促排周期和自然周期；染色體異常；擬行PGT者。

1.2 子宮內膜準備方案 對排卵障礙或月經周期不規律以及排卵期內膜<7mm的患者，于經期3～5天開始口服補佳樂4mg/d(戊酸雌二醇片，拜耳，德國)。用藥7天后，B超監測子宮內膜變化，根據內膜形態、厚度予以評估并記錄，結合當日激素水平適當調整用藥劑量和方案。內膜厚度大于7mm時，每日肌內注射40～60mg黃體酮注射液。從注射黃體酮第1天記為孕酮作用內膜1天，擇期選擇冷凍胚胎復蘇，適時移植。胚胎移植后繼續給予至少14天的外源性黃體酮支持。按孕酮作用內膜時間-移植第幾天胚胎分為：3-3組(孕酮作用內膜3天移植D3胚胎)，3-4組(孕酮作用內膜3天移植D4胚胎)，4-3組(孕酮作用內膜4天移植D3胚胎)和4-4組(孕酮作用內膜4天移植D4胚胎)。

1.3 胚胎評分與選擇 按SART胚胎評分系統標準對卵裂期胚胎進行評分[9]，將細胞數、碎片和卵裂球均一度三個指標整合在一個胚胎評分中。選擇細胞數目大于5，碎片小于25%，均一度中等或更好的作為冷凍選擇標準，于D3采用快速玻璃化法冷凍，各組間均挑選冷凍時評分為優質胚胎進行復蘇后移植。D3胚胎移植于當天解凍，培養2～4h后移植。D4胚胎移植于前日解凍，過夜培養后移植。

1.4 標準判斷 種植率指行胚胎移植術后4周，B超下見到的孕囊總數占移植胚胎總數的百分比。臨床妊娠是指胚胎移植4周后B超介導下子宮內可見孕囊且有胎心搏動。臨床妊娠率指臨床妊娠數占移植周期總數的百分比。早期流產率指12周之內自然流產數與臨床妊娠數之比。持續妊娠率指連續12周處于宮腔內妊娠數與移植周期數之比。

2 結 果

2.1 患者基本特征 4組患者年齡、不孕年限、子宮內膜厚度、體質量指數(body mass index,BMI)和移植胚胎數比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 患者的一般情況

2.2 孕酮作用內膜時間與移植胚胎同步的臨床結局 3-3組的種植率(25.4%)明顯低于4-4組(37.3%)(P<0.05)，臨床妊娠率和持續妊娠率(37.5%和31.1%)低于4-4組(53.1%和46.5%)，但差異無統計學意義(P>0.05)。兩組的早期流產率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 不同移植胚胎時間的臨床結局 孕酮作用內膜3天時，3-3組的種植率、臨床妊娠率和持續妊娠率低于3-4組，差異無統計學意義(P>0.05)。孕酮作用內膜4天時，4-4組的種植率和臨床妊娠率(37.3%，53.1%)均明顯高于4-3組(23.4%，34.4%)(P<0.05)。見表2。

2.4 不同孕酮作用時間的臨床結局 移植第3天胚胎時，3-3組與4-3組的種植率、臨床妊娠率、持續妊娠率和早期流產率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。移植第4天胚胎時，3-4組與4-4組的種植率、臨床妊娠率、持續妊娠率和早期流產率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組患者的臨床結局比較

3 討 論

隨著低溫生物學的發展，胚胎冷凍技術廣泛應用于臨床，FET的臨床結局也備受關注。胚胎植入是一個高度復雜且受多因素影響的過程，成功的植入與妊娠需適當發育的整倍體胚胎與容受性內膜達到同步化[10]。在臨床實踐中，要達到這種同步化，一方面是植入胚胎時期的選擇，另一方面是對子宮內膜容受性的準確評估與促進[11]。激素替代周期、促排周期和自然周期是凍融胚胎移植中應用最普遍的內膜準備方案，不同方案的妊娠結局無統計學意義[6,12]。HRT-FET是通過外源性雌、孕激素替代模擬人類正常月經周期，用藥方便且無需對患者的卵泡發育情況進行持續監測，具有較強的操作性及可控性[13]。值得注意的是，HRT期間患者需持續依靠外源性的黃體支持[14]。研究表明，HRT周期中延長孕酮連續暴露內膜時間，可延長內膜容受期限，增加胚胎與內膜作用頻次，從而獲得更好的種植結局[15]。本研究結果顯示，孕酮作用內膜時間和移植凍融胚胎同步時，4-4組的種植率顯著高于3-3組。表明孕酮作用內膜4天同時移植第4天胚胎比孕酮作用3天同時移植第3天胚胎有更好的種植結局。

目前無論是新鮮移植周期還是冷凍移植周期，卵裂期胚胎移植主要以第3天為主[16]。郭藝紅等[17]研究顯示，孕酮作用于小鼠子宮內膜后，適當延遲胚胎移植時間仍可獲得滿意的妊娠結局。Tao等[18-19]研究表明，不同時期胚胎的非整倍體比例不同，6-10細胞階段胚胎的非整倍體率高達60%，而發育到16-32細胞(桑椹胚)時的非整倍體率可降低一半，移植D4胚胎持續妊娠率明顯高于D3。有研究表明，與D5囊胚移植相比，移植D4桑椹胚的妊娠結局無明顯降低，并且較D3卵裂期胚胎植入更為有利，這是因為胚胎暴露于子宮環境的時間與自然生理狀態更接近，且胚胎在解凍之后繼續培養，有助于挑選卵裂球生長發育潛能更好的胚胎移植[20]。本研究結果提示，胚胎與孕酮作用內膜不同步的3-4組比胚胎與內膜同步的3-3組似乎有更好的妊娠結局。延遲孕酮作用時間與胚胎移植時機到第4天有更佳的臨床結局，這可能與胚胎繼續培養后的選擇有關。

子宮內膜只有在短暫的“種植窗”期允許胚胎著床，而孕酮是開啟種植窗的關鍵因素[21]。種植窗開放于黃體中期，在排卵后的6～8天子宮內膜容受性最大，此時是胚胎種植成功率最高階段[22]。曹鵬燕等[23]研究發現，孕酮作用內膜一定時間內(3.5～5天)均可移植卵裂期胚胎，并且臨床結局間無顯著差別。楊柳等[24]研究表明，延長激素替代周期中雌、孕激素用藥時間可刺激內膜達到理想狀態,提高臨床妊娠率。董梅等[25]研究發現，相對3天而言，黃體酮轉化4天可能有更好的臨床結局。本研究中，移植相同天數胚胎時，孕酮作用內膜3天和孕酮作用內膜4天具有相似的臨床結局。

本研究結果與臨床實踐提示，同步孕酮作用內膜時間與移植胚胎時期是提高種植結局的關鍵，與常規的第3天卵裂期胚胎移植相比，兩者同時延遲一天能獲得更滿意的妊娠結局。孕酮轉化子宮內膜3～4天似乎是“平臺期”，在“平臺期”內移植同一時期的胚胎均可獲得相似的臨床結局。因此，HRT周期的凍融胚胎移植可更加靈活地安排臨床和實驗室工作。本研究樣本量較小，有待擴大樣本量并采用隨機對照的方法進一步研究。