富血小板血漿在改善反復種植失敗患者妊娠結局中的作用

劉科鵬,高 珊，李麗斐，趙 薛，郭雅瓊，劉 媛,張學紅

(1.蘭州大學第一醫院生殖?？漆t院，蘭州 730000;2.西北民族大學，蘭州 730000;3.甘肅省衛生職業學院，蘭州 730000)

近年來輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)有了很大的發展，但反復種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)仍是臨床醫生和許多患者共同面臨的難題。歐洲人類生殖與胚胎學學會將RIF定義為：連續3次移植，其中每個周期轉移1～2枚高質量的胚胎，或在多次移植中轉移10個或10個以上胚胎，胚胎移植5周或更長時間后，在超聲檢查中沒有觀察到妊娠囊[1]。植入和妊娠受胚胎和母親因素的影響，胚胎因素與遺傳異?；蚺咛ス逃械钠渌蛩赜嘘P。母親因素包括子宮解剖形態異常、免疫因素、子宮內膜容受性降低和血栓形成[2]，其中子宮內膜容受性降低導致的移植失敗占總數的2/3以上[3]。目前臨床上有多種方法用于治療RIF，但是其療效往往不佳，因此迫切需求一種新的治療方案。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)包含多種生長因子和細胞因子：血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)，成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，胰島素樣生長因子I，II(insulin-like growth factors，IGF I，II)，轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)，結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和白介素8(interleukin 8，IL-8)。這些生長因子和細胞因子可促進各種細胞的增殖、遷移和組織再生[4]。研究表明，在IVF周期中，PRP宮腔灌注可改善薄型子宮內膜患者的子宮內膜厚度和子宮內膜容受性，繼而改善妊娠結局[5-6]。本研究設計前瞻性對照試驗，以評估PRP宮腔灌注可否改善RIF患者IVF周期的妊娠結局。

1 資料與方法

1.1 研究人群 采用單中心前瞻性對照試驗(平衡隨機)，選取2018年6月至2019年7月在蘭州大學第一醫院生殖?？漆t院擬行凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)周期的176例RIF患者，患者經3次或3次以上移植優質卵裂期胚胎后仍未受孕，擬再次行FET。納入標準:年齡低于40歲，體質量指數(body mass index,BMI)低于30kg/m2，根據形態學評估至少可獲得一枚優質胚胎。排除標準：女方子宮異常(先天性或后天性)，激素異常，夫妻中一方染色體異常，免疫學和血液學異常，男方因素導致的異常。按納入排除標準排除49例患者，其余127例進入下一步研究。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 根據治療方案將患者隨機分為PRP組和對照組,對患者進入周期前行宮腔鏡檢查。對患者的血栓形成、抗磷脂抗體、激素紊亂、血液學和免疫學疾病進行實驗室檢查。參與者均行FET周期治療，并使用激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)準備子宮內膜。FET周期方案：從月經周期的第2天開始口服戊酸雌二醇(Bayer Schering Pharma，法國)6mg/d，于周期第10天行陰道超聲檢查。如子宮內膜厚度未達到7mm，將戊酸雌二醇使用量增加至8mg/d。子宮內膜厚度超過7mm時，2次/d使用400mg孕酮栓劑(Cyclogest；Actavis，英國)進行內膜轉化，持續3天后進行胚胎移植，移植的胚胎中至少有1個為優質胚胎。所有移植過程均在超聲指導下由同一名婦科醫生進行。胚胎移植步驟根據2013年美國生殖醫學學會(ASRM)指南[7]。PRP組于胚胎移植前48h進行宮腔灌注PRP 1ml。胚胎移植后持續補充戊酸雌二醇和孕酮2周，如發生妊娠，則持續補充至妊娠12周。

PRP的制備及灌注:在灌注當天使用兩步離心法從自體血液中制備PRP。在預裝有1.5ml檸檬酸鹽抗凝溶液(ACD-A)的注射器中抽取8.5ml外周靜脈血，300×g離心10min。血液分為三層：底部紅細胞、上清液的血漿以及中間的血沉棕黃層。將血漿層和血沉棕黃層收集到另一離心管，700×g再次離心15min，最后獲得1.5ml PRP，其濃度約為循環血液的4～5倍。立即使用胚胎移植(ET)管將約1ml PRP注入子宮腔。

1.3 觀察方法及指標 主要觀察指標：患者的胚胎種植率、化學妊娠率、臨床妊娠率和持續妊娠率。胚胎種植率定義為胚胎移植后5周在陰道超聲下觀察到的妊娠囊與移植胚胎數的比值?；瘜W妊娠定義為胚胎移植后14天血清β-HCG≥50IU/L，臨床妊娠定義為胚胎移植后5周在陰超下觀察到妊娠囊和胎心搏動，妊娠20周后繼續妊娠時即為持續妊娠。次要觀察指標：胚胎移植日子宮內膜厚度、子宮動脈搏動指數(pulsatility index，PI)和子宮動脈阻力指數(resistance index，RI)。每例患者測量2次，并取平均值作為最后取值。

2 結 果

2.1 一般資料比較 176例無系統性疾病的RIF患者中，127例完成了本研究。兩組患者的年齡、BMI、移植失敗次數、不孕類型比較，差異無統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者的一般臨床資料

2.2 治療后兩組間子宮內膜厚度、子宮動脈血流參數比較 胚胎移植日PRP組的子宮內膜厚度均大于對照組(P<0.05)，PI、RI均小于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組胚胎移植日子宮內膜厚度、子宮動脈血流參數比較

2.3 兩組的妊娠結局比較 PRP組的胚胎種植率顯著高于對照組(24.4% vs 12.6%，P<0.05)。PRP組的臨床妊娠率顯著高于對照組(39.6% vs 18.8%，P<0.05)，見表3。

表3 兩組的妊娠結局

3 討 論

子宮內膜容受性降低，子宮解剖形態異常，薄型子宮內膜，免疫異常，血栓形成，胚胎異常均可導致RIF。RIF是限制IVF成功率的主要因素之一。目前臨床上有多種方法用于治療RIF，其療效往往不佳，迫切需求一種新的治療方案。

PRP被定義為“血小板計數高于基線的血漿”[8]。在正常生理條件下，血小板中所包含的多種組分協同作用以促進創面愈合。血小板攜帶近900種蛋白質，包括細胞因子、生長因子、干細胞、淋巴細胞、漿細胞和中性粒細胞的趨化因子，負責1400多種生物活性因子的翻譯后調節[9]。血小板中所含的生長因子具有修復組織、促進有絲分裂、趨化、新生血管和抗炎作用的能力[10]。PRP已應用于多個醫學領域，包括糖尿病性潰瘍、骨關節炎、肌腱炎、牙齒疾病、美容修復、神經損傷、心肌損傷和脫發[11-14]。

子宮內膜接受植入胚胎僅限于排卵后6～12天左右，這段時間被稱為種植窗口期。在種植窗口期，生長因子、細胞因子、前列腺素和黏附分子表達增加，這些生長因子表達異常會降低胚胎植入率和臨床妊娠率。Green等[15]證明了IGF I在植入過程中的基本作用。Sak等[16]研究表明，在RIF女性的子宮內膜中，生長因子(如血管內皮生長因子)表達減少。因此，通過宮腔灌注PRP補充各種生長因子，可能有益于調節和改善子宮內膜容受性，提高胚胎植入率和臨床妊娠率。

2015年Chang等[17]首先提出了PRP宮腔灌注可促進薄型子宮內膜生長，5例因子宮內膜過薄而取消周期的患者，經PRP宮腔灌注治療后，子宮內膜厚度增加至8mm以上，其中4例獲得妊娠。隨后一項前瞻性隊列研究中，45例RIF婦女在胚胎移植前48h接受了PRP宮腔灌注，其中PRP的濃度是血小板的4～5倍，共計19例患者獲得臨床妊娠[18]。這些臨床試驗均表明PRP宮腔灌注可改善薄型子宮內膜婦女的妊娠結局。PRP宮腔灌注在胚胎植入過程中的分子機制可能為：(1)活化的PRP直接促進人子宮內膜上皮細胞、子宮內膜基質成纖維細胞、子宮內膜間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)和源自骨髓的MSC的增殖和遷移[19]；(2)PRP在胚胎植入過程中對增殖、凋亡、炎癥、細胞黏附、趨化性和免疫反應的調節作用[20]；(3)通過多種途徑促進細胞再生、增殖和新生血管的形成[21]；(4)通過化學吸引作用促進細胞遷移和分化[22]；(5)刺激促炎性細胞因子(IL1A，IL1B，IL1R2)、趨化因子(CCL5，CCL7，CXCL13)和基質金屬蛋白(MMP-3，MMP-7，MMP-26)的表達，進而影響子宮內膜容受性[23]。

本研究結果顯示，RIF患者再次IVF-ET過程中行PRP宮腔灌注有助于改善妊娠結局，PRP組與對照組相比較，胚胎種植率(24.4% vs 12.6%)、臨床妊娠率(39.6% vs 18.8%)均顯著提高(P<0.05)，PRP組的子宮內膜厚度高于對照組，而子宮動脈PI和子宮動脈RI都小于對照組，子宮內膜血流呈低阻力。提示PRP宮腔灌注可促進內膜的生長，增加子宮內膜厚度，改善子宮內膜血流，增加胚胎種植的營養供給，繼而有可能改善了子宮內膜容受性。

綜上所述，富血小板血漿宮腔灌注有助于改善RIF患者的妊娠結局。但本研究樣本量較小，仍需大樣本隨機對照試驗的數據支持。