HPV16/18基因DNA存在狀態與宮頸病變發展的研究

侯 任，盧 劍，楊曉宇，張為遠

(1.桂林醫學院附屬醫院，廣西 541000；2.首都醫科大學附屬北京婦產醫院，北京 100020)

宮頸癌是女性第四大常見惡性腫瘤及第四大因惡性腫瘤死亡的疾病，世界上每年有約569847例新患病例，約311365例女性死于該疾病。在經濟欠發達地區，宮頸癌的死亡率仍僅次于乳腺癌位居第二[1]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomaviruss,HR-HPV)持續感染是高級別上皮內病變發生并發展為宮頸癌的主要和必需因素，據統計99%的宮頸癌與HPV感染有關，而HPV16和HPV18亞型感染是世界上最為廣泛流行的兩種高危亞型，分別導致了約70%的宮頸鱗狀細胞癌及約90%的宮頸腺癌[2]。本課題組前期研究發現[3]，HPV16是導致北京市婦女宮頸病變惡性進展的最主要HPV亞型。HPV18是北京市婦女易感的5種主要HPV亞型之一，但與HPV16相比，其感染率較低。HPV是一種常見的小DNA雙鏈病毒，HPV基因組中包含開放閱讀框(open reading frame，ORF)的DNA編碼鏈可分為3個區域，即早期蛋白編碼區(early region，ER)、晚期蛋白編碼區(late region，LR)，非編碼區：長控制區(long control region，LCR)。早期區域編碼8個開放閱讀框，其產物E2、E6和E7均參與HPV DNA的整合調控。E2蛋白是一種調節蛋白，參與病毒DNA復制、游離基因維護和病毒轉錄，E2基因的斷裂缺失和表達缺少解除了對E6、E7基因的抑制作用，導致E6、E7基因過度表達。而E6、E7蛋白分別通過與抑癌基因p53和pRb結合，導致p53蛋白和pRb蛋白失活，最終導致感染HR-HPV細胞持續增殖，是病毒基因發生整合的重要標志[4]。本文通過real-time PCR技術檢測HPV16和HPV18兩種亞型的DNA在宿主細胞中的存在狀態，探討這兩種亞型感染與宮頸病變發生發展之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 156例石蠟標本取自2016年1月至2018年2月北京婦產醫院婦科及腫瘤科。入選標準：年齡20～68歲；無全子宮切除史；無宮頸手術史；近兩年內無婦產科檢查和(或)藥物治療史；無盆腔放射治療史；近3天無性生活的已婚女性。予以行宮頸液基細胞檢查(ThinPrep liquid-based cytology test，TCT)后根據細胞學TBS-2014(the Bethesda system，宮頸/陰道細胞診斷報告系統)分類法診斷標準，提示為意義不明的不典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)及以上病變，包括低度鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)、高度鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)。經HPV快速導流雜交法(檢測試劑及儀器由潮州凱普生物化學有限公司提供)分型檢測明確為HPV16感染者132例，HPV18感染者24例。宮頸活組織檢查提示宮頸炎癥17例，宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級20例，CINⅡ級45例，CINⅢ級48例，宮頸癌(cervical cancer，CC)26例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 DNA提取試劑盒購自潮州凱普生物化學有限公司；PCR擴增試劑盒購自美國ABI生物科技公司；RT-PCR儀選自美國ABI 7300 real time-PCR儀；引物、Taqman探針由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

1.2.2 DNA提取 將宮頸活組織標本立即于10%甲醛固定液中固定24h，常規石蠟包埋，將石蠟包埋的標本切為5μm厚切片，取5片置1.5ml PE離心管，脫蠟、晾干。加DNA提取液，經孵育、震蕩、離心、洗脫，提取DNA，溶于60μl游離水，-20℃儲存備用。

1.2.3 實時定量PCR反應 采用實時定量PCR(real time PCR，RT-PCR)進行HPV16和HPV18型整合狀態檢測，分別擴增HPV16 E2和E6基因及HPV18 E2和E7基因。HPV整合狀態的檢測均在不知道細胞學或組織學結果的情況下進行，所用引物見表1，反應體系及反應時間按照試劑說明書進行。

表1 RT-PCR所用引物

1.2.4 HPV16和HPV18 E2、E6/E7基因擴增產物的半定量分析 繪制HPV16的E2和E6標準曲線及HPV18的E2和E7標準曲線。依據標準曲線計算機自動根據每一待檢標本的擴增曲線所確定的E2和E6/E7的Ct值，計算各模板的E2、E6/E7起始拷貝數。通過E2/E6或E2/E7比值判斷HPVl6和HPV18感染的體內狀態：E2/E6或E2/E7比值接近或大于1為HPV感染游離狀態；0

圖1 HPV16不同存在狀態的E2、E6 RT-PCR產物凝膠電泳圖像N：陰性空白對照；1～2：HPV16游離狀態；3～4：HPV16整合狀態；5～6：HPV16混合狀態

圖2 HPV18不同存在狀態的E2、E7 RT-PCR產物凝膠電泳圖像N：陰性空白對照；1：HPV18混合狀態；2～3：HPV18整合狀態；4～5：HPV18游離狀態

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0進行統計分析。應用χ2檢驗初步分析HPV16和HPV18各種存在狀態對宮頸組織病變及細胞學的影響。應用比值比(odds ratios，OR)值和95%可信區間(95% confidence intervals，95%CI)用于描述HPV整合狀態與宮頸病變的關聯強度。所有統計為雙側檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HPV16 DNA存在狀態與宮頸病變的關系 HPV16陽性的132例宮頸組織中包括宮頸炎癥組織11例，CINⅠ 15例，CINⅡ 40例，CINⅢ 48例，CC 18例。炎癥組織中均未見整合形式的HPV16出現，均為游離型HPV16感染。游離型HPV16存在于各個級別的宮頸組織中，隨宮頸病理學級別的升高，游離型HPV16的感染率逐漸降低，E2基因出現斷裂的比率逐漸升高，但各組相比并無統計學差異(OR=0.625，95%CI=0.151～2.586，P>0.05，r=0.113)。游離和整合基因構成的混合型HPV16感染率隨宮頸病變級別升高而升高，特別在CINⅢ和CC中，混合型HPV16感染率最高(39.6%和38.9%)。CINⅡ和CINⅢ組的混合型HPV16感染率有顯著差異(P<0.05)，其他幾組相比較無統計學差異(P>0.05)。各級別宮頸病變組相比較，HPV16完全整合率無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 HPV16 DNA存在狀態與宮頸病變的關系

*P<0.05 vs CINⅡ

2.2 HPV18 DNA存在狀態與宮頸病變的關系 HPV18陽性的24例宮頸組織中，宮頸炎癥組織6例，CIN組織10例，CC組織8例。HPV18陽性的炎癥組織中HPV常以游離形式存在(66.7%)，在宮頸病變的早期(CINⅠ)中病毒以完全整合形式的比率達60%，但在高級別宮頸病變中的完全整合率僅為20%，兩者相比有顯著差異(P<0.05)。8例CC組織中HPV18均以完全整合狀態存在。所有研究組中，僅CINⅠ組中有混合形式的HPV18存在(20%)，而其他各組中HPV18僅以游離型和完全整合型的狀態存在(表3)。

表3 HPV18 DNA存在狀態與宮頸病變的關系

2.3 HPV DNA整合與宮頸細胞學改變的關系 納入研究的宮頸細胞學為ASCUS及以上的HPV16/18感染的156例宮頸組織中，細胞學判讀為ASCUS的病例35例，LSIL 47例，HSIL 74例。HPV16/18感染的宮頸脫落細胞中，多數HPV以游離形式存在于各級別的細胞學判讀級別中，隨著細胞學判讀級別的升高，以游離形式的HPV所占比率從ASCUS的74.3%降至HSIL的52.7%(χ2=10.863，P<0.05)，完全整合形式的HPV并沒有隨著細胞學嚴重程度的增加而明顯增加(χ2=0.090，P>0.05)；但是鄰近的細胞學判讀級別之間,HPV的3種存在形式均無統計學差異(表4)。

表4 HPV16/18基因存在狀態與細胞學結果的關系

3 討 論

宮頸癌是目前唯一可通過早期篩查及早期干預就能降低其發病率及死亡率的婦科惡性腫瘤。CIN的惡性進展是宮頸浸潤癌發生的基礎，但仍有約60%的CIN出現良性轉歸。臨床上病理診斷為CINⅠ～Ⅱ，并不能根據形態學的改變來預測其發展的趨勢。病毒基因整合于宿主細胞中，既往認為是HPV導致宮頸病變惡性進展的主要標志及關鍵步驟[6]。E6和E7蛋白與細胞周期調節蛋白相互作用，具有致癌能力。典型的病毒基因的整合過程是E2基因斷裂，同時伴有E6/E7基因的過度表達。E6和E7都不具有內源性酶活性，但通過與宿主細胞蛋白的直接和間接相互作用而發揮作用，最終導致DNA復制過程的紊亂，促使HPV基因整合到染色體，造成宿主細胞的不穩定[6-7]。與此同時，E2基因斷裂也參與調節細胞凋亡和細胞增殖的表達[8]。HR-HPV持續感染發展至宮頸高級別瘤變的風險較高，可能因病毒基因組以整合狀態存在時，一方面難以被細胞免疫所清除，另一方面由于E2負調控蛋白的缺失增加了病毒癌基因的表達，這些因素均促進了病毒持續感染的發生[9]。

本研究中，CINⅠ組織中HPV16 E2基因斷裂率為33.3%，并且完全以整合形式存在可達13.3%；HPV18感染的病例中，正常組織中完全整合率達33.3%。在宮頸病變早期發生的HPV整合狀態，可能是在HPV感染的宮頸上皮細胞中，E6和E7蛋白的過表達明顯增加了宮頸病變早期階段的宿主細胞染色體畸變發生率，而導致宿主細胞發育不良[10]。這些發生染色體畸變的宿主細胞可存在于低級別病變甚至正常宮頸組織中，但成為宮頸病變惡性進展的前提。一項對428例宮頸HPV16陽性婦女進行跟蹤隨訪研究顯示，持續感染的HPV16常以整合形式存在，證實宮頸病變程度可能與病毒載量之間無顯著相關性，而病毒與宿主基因組整合后，改變了基因的結構與功能，導致病變程度明顯升高[11]。感染HPV16的CINⅡ+組織很少發生逆轉為低級別病變的現象，而感染其他病毒的CINⅡ+組織可有40%發生逆轉[12]。這與本研究相似，隨著宮頸病變級別的升高，HPV16 E2基因出現斷裂的現象逐漸增高，在CC組織中可達44.5%，但與已發生宮頸病變的各組組織相比，并無明顯的統計學差異?？赡苁且騂PV16的整合形式可形成一個超級增強子樣的元件來驅動病毒癌基因的轉錄，并且超級增強子除了驅動E6/E7的高表達外，還能促進鄰近基因的轉錄，提高了病毒感染的持續性[13]。這也可以解釋在本課題組前期研究發現的HPV16在各個病理級別中的感染率均較高的現象[3]。

HPV18陽性宮頸病變組織的E2基因斷裂情況比HPV16陽性常見，幾乎所有的HPV18均以整合的形式存在于宮頸癌組織細胞中；HPV16感染的宮頸組織中，即使在CC中病毒也常以游離狀態和整合狀態的混合形式出現，而整合率并不高[14]。這與本研究結果相似，HPV16感染的宮頸癌組織中，以整合形式存在的HPV16占44.5%(包括混合型和整合型)，而在HPV18感染的宮頸癌組織中，病毒卻全部以完全整合的形式存在。這可能是因為相較于HPV18 DNA，HPV16 3'LCR的甲基化水平較高，導致E2蛋白對E6和E7癌基因轉錄的負性控制喪失，使得在HPV16感染的宮頸癌組織中仍有游離的DNA存在，而在HPV18陽性組織中，E2基因斷裂發生頻繁[15]。推測在HPV16亞型感染的宮頸癌中，不僅僅因HPV整合這一個元素導致了宮頸病變的惡性進展，還可能與其他因素相關或協同作用有關。本研究還發現，HPV18感染的宮頸組織中，病毒的整合狀態分別以33%及60%的比例出現在宮頸炎癥組織和CINⅠ組織中，但CINⅡ+組織中僅占20%。這可能是因為HPV18型常與宮頸腺細胞癌相關，而腺細胞癌的發病率低，總樣本量少所致；此外與HPV18相關的病變常很快地經癌前病變的窗口期而直接迅速進展為宮頸癌[16]，在宮頸病變CINⅡ階段所能檢測到的病例量不足。因此，感染HPV18可能更易導致宮頸細胞染色體的不穩定性，使得較快經過高級別宮頸病變期而侵襲致宮頸癌[17]。

不同亞型的HPV基因的生物學性狀有很大差異，因此HPV16和HPV18感染的宮頸組織細胞中，不同病理級別中病毒的整合水平可能直接關系到病毒的傳染性和持續感染性[18]。HPV16雖然常以游離的形式存在，但是傳染性較高，持續感染時間久；HPV18的感染率雖很低，但卻較快經過癌前病變期進入宮頸癌期。

在宮頸細胞學與HPV存在狀態的研究中，宮頸細胞學為ASCUS的病例中有17.1%的整合狀態的HPV16/18存在。這是病毒基因整合到宿主細胞作為宮頸病變的早期事件在細胞學的另一個體現。在各級別細胞學改變中均有游離或整合形式的HPV存在，這與之前學者得出的結論不同，在細胞學陰性或LSIL以下的宮頸細胞中只存在游離形式的HPV，而高級別的細胞學改變中沒有單純游離形式的HPV存在[19]。隨著細胞學病理級別的增高，游離型HPV16/18的感染率逐漸降低(74.3%，61.7%，52.7%)，雖然病毒以游離的形式存在于宮頸病變的各個時期，但E2基因的斷裂/消失情況逐漸增多?？梢姴《景┗虻拇嬖跔顟B和表達可以作為評估宮頸病變惡性進展的輔助手段，從而有助于預測宮頸病變的進展[20]。

總之，HPV基因的整合會在宮頸疾病的早期進展過程中出現，而整合現象的出現并不是導致宮頸疾病惡性進展的獨立危險因素，而是一個重要的分子生物學過程。病毒整合狀態的檢測比單純HPV分型檢測更有臨床意義，整合狀態的檢測可作為一種生物標記用來預測宮頸病變的進展情況以用來評估宮頸惡性腫瘤發生的風險。不同的HPV亞型在致病的生物學和分子學性狀有顯著的不同，了解不同亞型的HPV基因存在狀態對宮頸病變的規律有利于盡早準確判斷宮頸病變的惡性進展風險，提高宮頸疾病的防治效率，指導臨床治療及隨訪策略的制定，對預防性疫苗的改良和新的治療方法的研制也有著深遠的意義，也必將成為預防領域的新視角。