HBeAg陽性及陰性患者血清HBV RNA水平與乙肝相關肝纖維化情況的相關性分析

袁宇慧

[摘要] 目的 探討HBeAg陽性及陰性患者血清HBV RNA水平對乙肝相關肝纖維化的影響，為早期肝纖維化診斷和預測提供新方案。 方法 選取2016年10月至2019年9月我院確診的乙肝病毒感染的患者145例作為研究對象，進行HBV DNA、HBV RNA水平的檢測;通過肝活檢及相關生化指標評定肝纖維化分級、炎癥分級和肝臟儲備能力;通過多因素Logistic回歸分析，明確獨立危險因素;通過ROC曲線評價HBV RNA水平對乙肝相關肝纖維化預測的影響。 結果 HBeAg陽性患者的AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg陰性患者，差異有統計學意義（P<0.05）;在HBeAg陽性和陰性患者中，HBV RNA陽性組的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級均顯著高于HBV RNA陰性組，差異有統計學意義（P<0.05）;多因素Logistic回歸分析顯示，HBeAg陽性和陰性患者的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級是影響HBV RNA的獨立危險因素（P<0.05）;ROC曲線和效能評估檢測發現，HBV RNA評估HBeAg陰性患者肝纖維化分級和炎癥分級的曲線下面積（AUC）分別為0.721和0.763，特異度分別為69.5%和73.5%，敏感度為73.8%和75.4%。 結論 HBV RNA與乙肝肝纖維化具有相關性，對HBeAg陰性患者具有預測價值，值得臨床推廣。

[關鍵詞] HBV RNA;肝纖維化;HBeAg;相關性分析

[中圖分類號] R512.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）08-0001-05

Analysis on the correlation between serum HBV RNA level and hepatitis B related hepatic fibrosis in HBeAg positive and negative patients

YUAN Yuhui

Department of Hepatology， Xuzhou Infectious Disease Hospital in Jiangsu Province， Xuzhou? ?221000， China

[Abstract] Objective To investigate the impacts of serum hepatitis B virus（HBV） RNA level and hepatitis B related hepatic fibrosis in HBeAg positive and negative patients， and to provide a new scheme for early diagnosis and prediction of hepatic fibrosis. Methods A total of 145 patients with confirmed HBV infection from October 2016 to September 2019 were selected as the research objects， and HBV DNA and HBV RNA levels were detected. The levels of fibrosis， inflammation and liver reserve capacity were evaluated by liver biopsy and related biochemical indexes. Through multivariate Logistic regression analysis， the independent risk factors were identified. ROC curve was used to evaluate the impacts of HBV RNA level on the prediction of hepatitis B related hepatic fibrosis. Results The levels of AST， ALT and HBV DNA in HBeAg positive patients were all significantly higher than those in HBeAg negative patients， with statistically significant differences（P<0.05）. In HBeAg positive and negative patients， the levels of hepatic fibrosis， inflammation and child-pugh in the HBV RNA positive group were significantly higher than those in the HBV RNA negative group， with statistically significant differences（P<0.05）. It was shown by multivariate Logistic regression analysis that the levels of hepatic fibrosis， inflammation and child-pugh were independent risk factors of HBeAg positive and negative patients impacting HBV RNA（P<0.05）. It was shown by ROC curve and efficacy evaluation that the area under the curve（AUC） of HBV RNA in evaluating the levels of hepatic fibrosis and inflammation in HBeAg negative patients was 0.721 and 0.763， the specificity was 69.5% and 73.5%， and the sensitivity was 73.8% and 75.4%（P<0.05）. Conclusion HBV RNA is correlated with hepatitis B hepatic fibrosis， and has predictive value for HBeAg negative patients， which is worthy of clinical promotion.

[Key words] HBV RNA; Hepatic fibrosis; HBeAg; Correlation analysis

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是重要的公共衛生問題，極大程度地危及人們的生命財產安全[1]。慢性乙肝病毒感染患者具有很高的進展性肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的風險。因此，肝纖維化或肝硬化的早期診斷和嚴重程度評估對控制病情進展起著重要作用，有利于降低HBV感染相關終末期肝病的發病率和死亡率?，F如今，肝組織活檢是診斷肝纖維化或肝硬化的金標準，但由于肝組織活檢作為一種有創檢測，具有諸多局限性，如患者配合度較差、取樣標本大小位置差異性較大等[2]，所以更便捷、無創的評估乙肝肝纖維化患者病情的方法是臨床上迫切需要的。有研究表明，乙肝相關肝纖維化或肝硬化患者的血清HBV DNA處于低濃度狀態，但與肝纖維化密切相關的共價閉合環狀DNA（cccDNA）濃度仍較高，且復制活躍。由于肝組織內cccDNA分布不均及血清內雙鏈DNA干擾，cccDNA的肝組織和血清檢測難度大。血清HBV RNA作為cccDNA的直接轉錄體，能準確反映cccDNA水平[3]。因此，本研究探討血清HBV RNA水平與乙肝肝纖維化患者病情、肝纖維化程度及肝臟炎癥的關系及其對乙肝肝纖維化診斷價值評估，為提高臨床診斷提供新的研究基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月至2019年9月間我院收治的乙肝肝纖維化患者145例作為研究對象。年齡25～69歲，平均（48.49±9.55）歲。男97例，女48例。根據乙肝e抗原（HBeAg）攜帶情況分為HBeAg陽性組71例和HBeAg陰性組74例。納入標準：①患者符合2019年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，并分為無明顯肝纖維化期（S0～S1）和明顯纖維化期（S2～S4）;②臨床資料完整者。排除標準：①藥物性肝病、酒精性肝病或其他病因導致的肝纖維化或肝硬化者;②具有其他原因導致的肝損傷者;③合并惡性腫瘤或免疫系統疾病者;④伴有嚴重心、肺、腎等慢性疾病者;⑤昏迷或存在精神障礙者。本研究通過我院醫學倫理委員會審批，所有入組患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV DNA和RNA檢測? 采用COBAS Taqman HBV DNA載量試劑盒（羅氏Cobas，瑞士）檢測HBV DNA;采用HBV-pgRNA核酸檢測試劑盒（PerkinElmer公司，美國），通過核酸提取、反轉錄、擴增等過程檢測HBV RNA，操作均嚴格按照說明書執行。根據試劑盒檢測的下限，將檢出者稱為陽性，未檢出者稱為陰性。

1.2.2 肝穿刺活檢及纖維化和炎癥分級? 患者在超聲引導下進行肝穿刺，采用全自動一次性穿刺針（BARD，美國），取15～20 mm病理標本，常規石蠟切片后，行HE、Masson和網織纖維染色。由兩名病理科醫師雙盲閱片，根據2015年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》標準將肝組織病理切片纖維化程度分為無明顯肝纖維化期（S0～S1）和明顯纖維化期（S2～S4）;將肝組織病理切片根據炎癥程度分為輕度慢性肝炎（G1/G2期）和中、重度慢性肝炎（G3/G4期）。

1.2.3 血清生化及血清學指標的檢測? 患者清晨空腹抽血2～3 mL，4000 rpm離心10 min，分離血清，于-80℃保存。使用C701全自動生化分析儀（羅氏Cobas，瑞士）檢測丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）;采用ARCHITECTi2000SR（雅培ABBOTT，美國）經化學發光法檢測HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb和HBcAb，操作規程嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.2.4 肝臟儲備功能評價? 采用Child-Pugh分級標準對肝纖維化或肝硬化患者的肝臟儲備功能進行量化評估，根據腹水、總膽紅素、清蛋白、凝血酶原時間、肝性腦病分期將患者分為A級（5～6分，肝臟儲備功能較好）、B級（7～9分，肝臟儲備功能一般）和C級（≥10分，肝臟儲備功能較差）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗;采用多因素Logistic回歸分析HBV RNA的影響因素;采用ROC曲線評估HBV RNA的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBeAg陽性與陰性乙肝患者一般資料與臨床指標比較

HBeAg陽性與陰性患者的年齡、性別、TBIL、DBIL和IBIL比較，差異無統計學意義（P>0.05）;HBeAg陽性患者的肝功能指標AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg陰性患者，差異有統計學意義（P<0.05）;然而，HBeAg陽性患者的HBV RNA定量顯著低于HBeAg陰性患者，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 HBeAg陽性與陰性患者生化指標、纖維化分級、炎癥分級和肝臟儲備能力在HBV RNA陽性組和陰性組比較

HBeAg陽性患者中，HBV RNA陽性組與HBV RNA陰性組AST、ALT、HBV DNA陽性率水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），HBV RNA陽性組的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級顯著高于HBV RNA陰性組，差異有統計學意義（P<0.05）。HBeAg陰性患者中，HBV RNA陽性組AST、ALT、HBV DNA陽性率、肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級均顯著高于HBV RNA陰性組，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 影響HBeAg陽性與陰性患者HBV RNA的多因素Logistic回歸分析

以HBV RNA為因變量（y：HBV RNA陰性組=0，HBV RNA陽性組=1），以單變量分析中P<0.10的因素為自變量，進行變量賦值后，納入患者進行回歸分析。Logistic回歸分析顯示，在HBeAg陽性患者中，肝纖維化分級[OR=1.885，95%CI：1.245～2.673]、炎癥分級[OR=2.228，95%CI：1.725～2.518]和Child-Pugh分級[OR=2.046，95%CI：1.508～2.529]是HBV RNA的獨立危險因素（P<0.05）;在HBeAg陰性患者中，AST[OR=1.830，95%CI：1.526～2.238]、ALT[OR=1.682，95%CI：1.238～2.025]、HBV DNA陽性率[OR=1.772，95%CI：1.215～2.204]、肝纖維化分級[OR=2.374，95%CI：1.734～2.945]、炎癥分級[OR=2.058，95%CI：1.663～2.497]和Child-Pugh分級[OR=2.337，95%CI：1.823～2.852]是HBV RNA的獨立危險因素（P<0.05）。

2.4 HBeAg陽性與陰性患者HBV RNA對肝纖維化分級和炎癥分級的評價效能分析

分析HBeAg陽性與陰性患者的HBV RNA對肝纖維化分級和炎癥分級進行評估，繪制ROC曲線。見圖1。在HBeAg陽性患者中，HBV RNA評估肝纖維化分級和炎癥分級的曲線下面積（AUC）分別為0.633和0.606，特異度分別為43.6%和49.7%，敏感度為51.5%和47.3%（P>0.05）;在HBeAg陰性患者中，HBV RNA評估肝纖維化分級和炎癥分級的曲線下面積（AUC）分別為0.721和0.763，特異度分別為69.5%和73.5%，敏感度為73.8%和75.4%（P<0.05）。

3 討論

乙型肝炎病毒感染是導致慢性肝纖維化[5]、肝硬化[6]甚至肝癌[7]的主要病因之一，因此乙肝病毒感染后肝纖維化預防和病情評估十分重要?？笻BV治療有效的標準是血清學的轉換，其中HBeAg由陽轉陰具有重要意義[8]。然而有研究發現，HBeAg陰性患者仍可能繼發肝纖維化或肝硬化，這是由于在長期HBV感染中，患者可能對野生型HBV復制的耐受性降低，進而導致HBeAg轉陰，但HBV DNA可轉化為cccDNA，仍復制活躍[9]。乙肝肝纖維化是肝臟對因乙肝肝炎病毒引起的慢性炎癥損傷進行修復和愈合的結果，肝臟結構被破壞、改建中形成假小葉[10]，最終引起肝功能障礙、肝硬化和肝癌，因此乙肝病毒的長期活躍與肝纖維化密不可分。HBV RNA作為HBV未經逆轉錄的前基因組，可有效反映乙肝患者肝細胞內cccDNA的水平和轉錄活性，因此可能成為乙肝療效評價或乙肝肝纖維化預測的潛在指標[11]。

為明確HBV RNA對乙肝患者肝纖維化的作用，本研究根據HBeAg陽性/陰性將患者分為兩組，首先比較兩組間生化指標的差異，發現HBeAg陽性組AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg陰性組（P<0.05），但HBV RNA定量顯著低于HBeAg陰性組（P<0.05）。這種HBV DNA和RNA的差異型趨勢的原因可能是HBV DNA在抗病毒治療后可受到反轉錄抑制，HBeAg由于耐受轉陰，進而導致HBV DNA檢測數值降低，但HBV仍以cccDNA的形式不斷產生HBV RNA病毒樣顆粒，因此HBeAg陰性患者的HBV RNA仍居高不下[12]。彭亞夢等[13]研究發現，HBeAg陽性/陰性的HBV DNA與HBV RNA水平存在較大差異，HBeAg是CHB患者血清HBV RNA水平的影響因素，但HBeAg與HBV DNA不相關，提示相較于HBV DNA，HBV RNA能更好地反映HBeAg的轉陰情況。

本研究為探討HBV RNA在HBeAg陽性/陰性情況下對乙肝相關肝纖維化的影響，比較HBV RNA陽性組和陰性組間AST、ALT、HBV DNA、肝纖維化分級、炎癥分級和肝臟儲備能力的差異，發現HBeAg陽性/陰性情況下，HBV RNA陽性組的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級均顯著高于HBV RNA陰性組，提示HBV RNA可能與乙肝肝纖維化存在相關性。之后通過多因素Logistic回歸分析發現，HBeAg陽性患者的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級是HBV RNA的獨立危險因素;HBeAg陰性患者的AST、ALT、HBV DNA陽性率、肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級是HBV RNA的獨立危險因素。最后通過ROC曲線對HBV RNA預測肝纖維化進行研究發現，HBV RNA對HBeAg陰性患者肝纖維化的預測特異度和敏感度較好，提示HBV RNA對乙肝患者的肝纖維化具有評估作用，尤其是在HBeAg轉陰的患者中，HBV RNA的預測效能較高。這種情況的出現可能與乙肝的治療方法有關，目前核苷類藥物是乙肝活動期的主要治療手段，其對HBV DNA的抑制作用十分明顯，但對cccDNA作用有限，需要更長時間的持續用藥。蔣貝等[14]研究認為，在HBeAg陰性患者中血清HBV RNA僅來源于cccDNA的直接轉錄，故較HBV DNA和HBsAg更能反映cccDNA水平或活性，因此可以作為HBV轉錄活性的評價指標。另一項研究認為，HBV RNA持續陰性可作為部分治愈的依據，對預測停藥后復發或病毒學反彈風險具有意義[15]。Liu等[16]也認為HBV RNA可以反映肝纖維化程度，且具有較好的HBV轉錄活性評價效能，可以作為一種新的乙肝治療停藥指標。

綜上所述，HBV RNA與乙肝肝纖維化具有相關性，尤其是在HBeAg陰性患者中，HBV RNA具有乙肝肝纖維化的較好預測效能，但本研究病例數較少，對于肝纖維化各期HBV RNA變化仍需進一步大樣本量的前瞻性研究。