超高效液相色譜-串聯質譜結合內標法快速檢測毛發中15種毒品及代謝物

胡駿杰， 郝敬梅， 劉 飛， 杜 樂， 朱 軍， 上官國強

(1.濟寧醫學院司法鑒定中心，山東濟寧 272067;2.濟寧醫學院法醫學與醫學檢驗學院，山東濟寧 272067;3.南京大學化學化工學院，生命分析化學國家重點實驗室，江蘇南京 210023)

自2016年11月國家禁毒辦對《吸毒成癮認定辦法》修訂以來，毛發中毒品及代謝物的檢測結果已被作為吸毒成癮認定的新標準[1,2]。個體在吸食或注射毒品后，相關成分及代謝物進入毛發并穩定儲存在其中[3]。相較于血液、尿液、唾液等常規生物檢材，毛發具有檢測窗口期長、易于采集和便于保存等特點[4 - 6]。從某種程度上說，每段發絲就像一臺“時光機”，記錄著各種藥毒物的代謝情況，可追溯長達幾個月甚至幾年的涉毒行為[7]。因此，高效精準毛發分析方法的建立，對掌握毒品代謝規律、順利開展禁毒工作意義重大。

毒品及代謝物的分析主要包括氣相色譜-質譜(GC-MS)法[8,9]和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法[10 - 12]。近年來隨著LC-MS/MS儀器性能的提升，該方法已被作為毛發中毒品分析的“首選”及“優選”[13,14]。但目前毛發分析技術仍面臨前處理流程繁瑣、痕量結果確證困難等挑戰?；诖?，本研究采用具有較高效率的高動能研磨法處理毛發檢材，并對提取流程進行了簡化；建立基于QTRAP質譜系統的分段多反應監測(Scheduled MRM,sMRM)、信息依賴性采集(IDA)、增強離子掃描(EPI)模式聯用的分析方法：結合EPI譜庫檢索對毛發中15種毒品及代謝物進行確證；通過加入內標監測儀器及樣品狀態，同時實現對相關化合物的定量檢測。該方法樣品前處理簡便快捷，分析流程快速高效，檢測結果準確靈敏，可為毛發中毒品的系統性篩查提供強有力的分析手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Biotage Lysera高效樣品破碎儀(瑞典，Biotage公司)；超高效液相色譜-串聯質譜系統：島津LC-30A型超高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)串聯SCIEX QTRAP 5500質譜儀(美國，AB SCIEX公司)。

苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、甲卡西酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、美沙酮、曲馬多、芬太尼、Δ9-四氫大麻酚、可卡因、苯甲酰愛康寧、雙苯戊二氨酯(SKF-525A，內標)標準品(質量濃度均為1.0 mg/mL)來自公安部物證鑒定中心，各化合物結構式見表1；NH4Ac(質譜級)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)購自德國Merck公司。實驗用水為超純水。

1.2 實驗條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex Biphenyl色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)；流動相A：5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min,5%B；1.0～1.5 min,5%～20%B;1.5～9.0 min,20%～95%B;9.0～11.0 min,95%B;11.0～11.1 min,95%～5%B;11.1～14.0 min,5%B。流速：0.5 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃。

質譜條件：離子源：ESI源；掃描方式：sMRM-IDA-EPI，正離子模式；離子源參數：離子源電壓(IS)：5 500 V；氣簾氣(CUR)：30 psi；霧化氣(GS1)：50 psi；輔助氣(GS2)：55 psi；離子源溫度：500 ℃。15種毒品及代謝物和內標化合物的MRM參數見表1。

表1 15種毒品及代謝物及內標化合物結構式、MS/MS采集參數和保留時間

(續表1)

1.3 MS/MS譜庫的建立

分別以50 eV、35 eV及20 eV三種碰撞能量在針泵直接進樣模式下，對15種毒品及代謝物標準品溶液進行EPI掃描，建立相關物質的MS/MS譜庫用于檢索，為目標物確證提供支持。

1.4 樣品前處理

將毛發樣品置于離心管中，以適量超純水和丙酮各振蕩洗滌1次，取出晾干。準確稱取25 mg毛發檢材，置于含撞珠的研磨管中，依次加入500 μL甲醇，5 μL濃度為500 ng/mL的SKF-525A內標溶液，3 400 r/min轉速下研磨破碎2 min。以0.22 μm有機相濾膜過濾研磨液后，進行UPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇實驗考察了甲醇、乙腈、超純水3種提取溶劑對毛發中15種毒品及代謝物的提取效果。結果顯示，乙腈對生物檢材中的蛋白成分有較強沉淀作用，導致毛發角蛋白中包覆的毒品及代謝物成分回收率較低；由于部分毒品及代謝物成分在水溶液中的溶解度較低，因而超純水提取效率低于甲醇。因此，甲醇對于毒品及代謝物成分的提取具有最廣泛的普適性，實驗選取甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 前處理流程的簡化對毛發檢材的研磨方式分為干磨與濕磨，據文獻報道濕磨法提取效果優于干磨法[15]，因此實驗選擇濕磨法。對含15種毒品及代謝物成分的毛發與甲醇混合研磨后，考察了超聲處理對提取效果的影響。結果顯示，對研磨管超聲2 h后過濾研磨液，與研磨后直接過濾研磨液進行UPLC-MS/MS分析各物質提取效率無明顯差別。因此，對毛發檢材與提取溶劑研磨后直接過濾分析，簡化了前處理流程，縮短了樣品分析時間。

2.2 質譜方法的建立

2.2.1 MRM方法的建立配制濃度為50 ng/mL各目標物的單標準溶液，以針泵直接進樣，確定各化合物母離子與子離子質荷比，優化去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等參數，建立正離子模式下15種毒品及代謝物的MRM分析方法。

2.2.2 掃描模式的選擇研究充分利用QTRAP 5500液-質聯用系統復合質譜技術優勢[16]，選取sMRM-IDA-EPI掃描模式，同時實現目標物的定性與定量分析。sMRM的檢測窗口時間設置為120 s，這有利于在保留時間附近捕捉并鎖定目標物，提高色譜峰響應值，同時作為IDA的預掃描，它將觸發EPI掃描，獲取相關物質的高靈敏二級譜圖，通過EPI譜庫檢索用于檢出物質的確證，對于毛發檢材中痕量物質的分析具有重要意義。

2.3 液相色譜條件的優化

2.3.1 色譜柱的選擇為確保各類化合物在色譜柱上有較好的保留及分離效果，實驗考察了Phenomenex Kinetex Biphenyl柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)與Venusil MP C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)兩種色譜柱的分離效果。結果顯示，各化合物在Phenomenex Kinetex Biphenyl柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)上的分離效果明顯優于Venusil MP C18柱，各目標物基本實現分離，峰形理想。

2.3.2 流動相的選擇實驗考察了甲醇和乙腈作為流動相中有機相對15種毒品及代謝物的分離效果。以甲醇作為流動相的有機相，在梯度洗脫程序下，考察了0.1%甲酸與0.1%甲酸加5 mmol/L NH4Ac對色譜峰峰形的影響。結果表明，流動相中NH4Ac的存在能明顯改善各物質峰形。因此，實驗選用5 mmol/L NH4Ac溶液(含0.1%甲酸水溶液)-甲醇作為流動相。方法優化后毛發基質中添加15種毒品及代謝物標準品和內標提取離子流色譜圖如圖1所示，其各自保留時間見表1。

圖1 毛發基質中添加15種毒品及代謝物標準品和內標化合物的提取離子流(EIC)色譜圖Fig.1 EIC chromatogram of 15 drugs,their metabolites and internal standard spiked in hair matrix

2.4 EPI譜庫檢索

分別在高、中、低三種碰撞能量下，對15種毒品及代謝物標準品進行EPI掃描，建立相關物質的EPI譜庫。在實際樣品檢測中，將sMRM-IDA-EPI掃描模式下獲取的EPI二級譜圖，進行譜庫檢索匹配，全面對比各物質的離子碎片特征信息：例如，EPI譜庫中甲基苯丙胺、氯胺酮、嗎啡的MS/MS譜圖(圖2A1～A3)與毛發基質中對應物質的EPI譜圖(圖2B1～B3)具有高度一致性。實驗中，sMRM 檢測方式提供了最高的靈敏度與特異性，MS/MS譜圖檢索為相關物質的確證提供了可靠支持，二者為毒物篩查與定量分析提供了強大的技術保障。

圖2 甲基苯丙胺、氯胺酮及嗎啡的標準品(A1-A3)與毛發基質中加標樣品(B1-B3)的EPI二級譜圖Fig.2 EPI MS/MS spectra of standard(A1-A3) and hair-spiked(B1-B3) amphetamine,ketamine and morphine

2.5 方法性能指標

2.5.1 檢出限、定量限、線性范圍及回歸方程準確稱取25 mg潔凈的空白毛發樣品14份，置于研磨管中，并在各管中加入1 mL一系列濃度梯度的15種毒品及化合物混標溶液，以N2吹干，制備成含毒品及代謝物0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mg以及5.0 ng/mg的7組毛發樣品，每個濃度組設置兩個平行樣。將各樣品按“1.4”流程前處理后，進行LC-MS/MS分析。以15種化合物定量離子對峰面積與SKF-525A定量離子對峰面積比值，對各物質含量作圖并進行線性回歸分析，得到回歸曲線方程及相關系數，見表2。在0.05～5.0 ng/mg范圍內，15種毒品及代謝物線性方程的相關系數R均大于0.995，方法檢出限(S/N≥3)0.5～10 ng/g，定量限(S/N≥10)10～35 ng/g。之前文獻中報道的毛發中毒品定量多采取外標法[10,16]，本研究采用內標法，以SKF-525A為內標，不僅可避免測定儀器、樣品基質等因素帶來的誤差，提高準確度，還可通過內標物的峰形、峰面積等因素監測樣品與儀器運行狀態是否正常。根據2018年公安部頒布《涉毒人員毛發樣本檢測規范》規定，各物質檢出限低于規定閾值，滿足實際需要。

表2 15種毒品及代謝物線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.5.2 回收率與重現性分別在空白毛發中添加低、中、高濃度混標，制成含0.05、0.2、1.0 ng/mg毒品及代謝物的樣品，每個濃度組設置6個平行樣品，按照“1.4”方法流程處理，與標準提取添加樣品做比，計算回收率，同時計算精密度。15種毒品及代謝物回收率在低、中、高三個添加濃度下回收率為89.2%～117.5%，相對標準偏差(RSD)為1.5%～7.1%，結果見表3。

表3 毛發中15種毒品及其代謝物的回收試驗(n=6)

(續表3)

2.6 實際樣品分析

從本實驗室2020年6月接收的毛發檢材中隨機抽取10份，編號為101～110，采用本方法分析，獲取MRM譜圖及EPI譜圖，并進行譜庫檢索比對，確證定性結果。進一步將檢出物離子對峰面積與內標化合物峰面積之比帶入標準曲線方程，計算相關物質含量。各樣品檢測結果見表4。108、109和110號樣品未檢出15種毒品及代謝物成分；101、102及103號毛發樣品檢出甲基苯丙胺，且102號樣品檢出代謝物苯丙胺，對應標準品及檢出代謝物提取離子色譜圖見圖3A；104、105號樣品檢出嗎啡；106、107號樣品檢出氯胺酮，其中107號樣品氯胺酮含量較高，同時檢出代謝物去甲氯胺酮，與標準品的提取離子色譜比對如圖3B所示。

表4 毛發樣品檢測結果

圖3 空白毛發中添加苯丙胺(A1)、去甲氯胺酮(B1)標準品(添加濃度0.2 ng/mg)與102號(A2)、107號(B2)樣品中檢出代謝物的提取離子色譜圖(EIC)比對Fig.3 Comparisons of EICs of standard amphetamine(A1) and normeketamine(B1) spiked in blank hair(spiked concentrations:0.2 ng/mg),and detected metabolites in No.102(A2) and No.107(B2)

3 結論

建立了毛發中15種毒品及代謝物的UPLC-MS/MS分析方法，應用sMRM-IDA-EPI掃描模式，結合譜庫檢索，確證定性結論；以內標法定量，準確靈敏。該方法前處理流程簡便快捷，采用EPI掃描獲取的質譜圖與譜庫進行匹配，增強了結果可信度，適用于毛發樣品的快速分析，為禁毒提供技術支持。