多光譜法結合分子模擬技術研究多西他賽與人血清白蛋白的作用

霍彩霞， 何麗君， 石 雷， 狄 婧， 田淑麗

(1.蘭州城市學院化學化工學院，甘肅蘭州 730070 2.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州 730070)

多西他賽(Docetaxel，DT)在臨床上用于治療乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等癌癥，該藥主要是通過生物細胞內的特殊調控抑制癌細胞的擴散，從而發揮特異性免疫作用[1,2]。作為紫杉醇的衍生藥物，DT的抗腫瘤活性優于紫杉醇，但會對人的運動神經、消化系統等表現出一定的毒副作用[3]。目前，多數藥物能夠達到治療效果的方式是藥物進入血液與蛋白結合形成配合物，經血液運輸到達人體患病處釋放藥物分子[4]。在藥物治療期間，通過水果及谷物攝入輔酶可以提高人體的抗氧化力和免疫力，但同時也會影響藥物的治療效果。有關DT的研究報道多見于高活性低毒性的多西紫杉醇劑型的開發[5,6]、治療機理及耐藥性的研究[7,8]、聯合藥物治療安全評價[9,10]等，對于DT和人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)相互作用的研究較少。

本文以DT和HSA作為研究對象，綜合利用熒光光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、圓二色譜法，并結合分子模擬對接技術，對DT與HSA的相互作用機理以及輔酶對DT-HSA體系的影響進行了詳細探究。從分子層面討論DT在人體內的藥用機制，為用藥期間的臨床試驗和食品攝入提供有益信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度儀(日本，島津公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本，島津公司)，Nicolet Is 10傅里葉變換紅外光譜儀(美國，Thermo Nicolet公司)；Olis DSM 1000雙光束圓二色光譜儀(美國，OLIS DSM公司)。

人血清白蛋白(HSA,Sigma)儲備溶液：用pH=7.40 Tris-HCl緩沖溶液配成1.0×10-5mol·L-1；多西他賽(DT)儲備溶液：先加1滴丙酮溶解DT(純度≥98%，貴州迪大生物科技有限公司)，再用無水乙醇配成1.0×10-3mol·L-1。華法林(Warfarin,WF)和布洛芬(Ibuprofen,IBU)溶液的濃度均為2.0×10-3mol·L-1；輔酶Q10(CQ10)、輔酶A(CoA)、維生素B1(VB1)、維生素C(VC)、核黃素(VB2)、維生素E(VE) 及L-氧化型谷胱甘肽(GSH)溶液，濃度均為1.0×10-4mol·L-1；溶液于4 ℃避光保存。實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

實驗2:于1 cm比色皿中移入3.0 mL HSA溶液，設定λex=220～302 nm，逐次增加1 nm,在溫度為298 K下，掃描HSA的熒光光譜；再加入40 μL 1.0×10-3mol·L-1的DT溶液進行反應，測定DT-HSA的三維熒光光譜；扣除等量緩沖溶液與配體的熒光干擾。

實驗3:以pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液為參比，測定HSA、DT及摩爾比為1∶1 DT-HSA體系的傅里葉紅外光譜，對DT-HSA體系和DT的紅外光譜差減得到與DT作用后HSA的紅外光譜。用軟件Nicolet Omnic和Peakfit V4.12對與DT作用前后HSA的紅外光譜酰胺Ⅰ帶進行Gauss峰擬合、基線校正、去卷積以及二階導數處理。

實驗4:以Tris-HCl緩沖溶液為參比，池徑1 mm，掃描速度2.2 nm·s-1，掃描HSA與DT-HSA體系在200～280 nm波長范圍內的圓二色譜，考察反應前后HSA中α-螺旋結構含量的變化情況。

實驗5:使用Schr?dinger 10.2和該軟件的Glide模塊分別進行人血清白蛋白與藥物的對接。先進行蛋白質結構準備，包括加氫、對缺失的原子和殘基及loop區進行修補等，進而產生格點，最后與配體分子進行對接。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅機理

圖1右上角為DT-Tris-HCl體系的熒光光譜曲線，在波長280 nm激發下，DT在310 nm處發射峰的熒光強度隨其濃度的增大而增強，同時對HSA在336 nm處的最大熒光特征峰強度也會產生影響，進行空白扣除。從圖1可看出，隨著DT濃度的增大，HSA的熒光發射峰強度有規律的降低，峰位發生明顯藍移，說明DT對HSA的內源熒光具有猝滅作用。以Stern-Volmer方程[13]處理實驗溫度下DT對HSA的熒光猝滅數據，得到猝滅速率常數Kq和動態猝滅常數KSV(表1)。KSV隨著溫度的升高而減小，同時，Kq值遠大于小分子對HSA的最大擴散碰撞猝滅常數2.0×1010L·mol-1·s-1，可初步推斷DT對HSA熒光的猝滅機制為靜態猝滅。

圖1 溫度309 K下DT對HSA的熒光發射光譜(pH=7.40)Fig.1 Fluorescence emission spectra of HSA in the presence of DT at temperature 309 K(pH=7.40)λex=280 nm;cHSA=1.0 μmol·L-1,cDT(1-8)=0,3.3,6.6,9.9,13.1,16.4,19.7,22.9 μmol·L-1.

表1 DT-HSA體系的猝滅常數、結合常數、結合位點數和希爾系數

由DT-HSA體系的紫外光譜(圖2)可知，隨著藥物濃度增大，HSA在波長278 nm處的吸光度逐漸增強，峰位藍移4 nm，表明DT與HSA結合形成配合物[13,14]。差譜圖顯示，DT-HSA與DT的差譜曲線(a)和HSA吸收譜線并不重合，這進一步佐證DT與HSA的相互作用為靜態猝滅過程。

圖2 溫度309 K下DT-HSA體系的紫外吸收光譜(插圖為差譜圖)Fig.2 UV spectra of DT-HSA system at temperature 309 K(The inset corresponds to the absorption spectra of HSA and the difference spectra between HSA-DT and DT at the same concentration,cHSA=cDT=10.0 μmol·L-1)cHSA=10.0 μmol·L-1,cDT(1-8):0,3.3,6.6,9.9,13.1,16.4,19.7,22.9 μmol·L-1.

2.2 結合常數、作用力和結合距離

DT與HSA的靜態猝滅作用符合公式：lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q][4]，求得二者間的結合常數Ka和結合位點數n(表1)。Ka隨實驗溫度升高而減小，結合常數達到103數量級，n近似等于1，說明DT分子在HSA有一個結合位點，二者作用形成1∶1的配合物。依據實驗溫度下DT-HSA體系的熱力學參數平均值(ΔH=-29.30 kJ·mol-1,ΔS=-24.94 J·mol-1·k-1,ΔG=-21.66 kJ·mol-1)，結合Ross等[15]的研究可判斷，DT與HSA通過氫鍵和范德華力共同作用，二者的結合是一個放熱、熵減自發進行的反應。

根據F?rter的偶極-偶極非輻射能量轉移定理可以計算出DT與HSA的結合距離[13]。HSA熒光光譜與DT紫外光譜圖疊加部分的積分面積J=1.49×10-10cm3·L·mol-1，臨界距離R0=0.78 nm，DT與HSA的結合距離r=1.48 nm<7 nm，且R0

2.3 藥物協同性

Hill方程的希爾系數nH可以用來分析配體分子與蛋白質結合的協同性作用。根據文獻報道[16]求得實驗溫度下的nH(表1)，由nH的平均值約等于1可知，DT分子與HSA中Tyr與Trp殘基的結合對后繼配體和蛋白質的結合影響不大，即無藥物協同作用。

2.4 結合位點的確定

首先通過比較激發波長在280 nm(同時激發Trp和Tyr殘基的熒光)和295 nm(只激發Trp殘基的熒光)時HSA的熒光猝滅程度，確定藥物與蛋白結合的具體位置[17]。在溫度309 K，對DT-HSA體系在λex/λem=280/336 nm和295/336 nm處的熒光強度進行F/F0～cDT/cHSA線性擬合，得到方程斜率k280=-0.0083 和k295=-0.0051，說明DT對HSA的猝滅曲線沒有重疊，且280 nm激發時降低程度更大，表明Trp和Tyr殘基均參與反應，DT在HSA中的結合位點主要處于亞螺旋域ⅡA。

另設定熒光探針華法林/布洛芬與HSA的濃度比為1∶15時測定DT-HSA體系的熒光強度。結果表明，溫度309 K下，三元體系WF-DT-HSA和IBU-DT-HSA的Ka與DT-HSA(4.19×103L·mol-1)相比，Ka(WF-DT-HSA)(24.5 L·mol-1)減小，Ka(IBU-DT-HSA)(1.93×104L·mol-1)增大，但華法林對Ka值的影響明顯大于布洛芬，說明華法林與DT共用同一個結合位點ⅡA siteⅠ[12]。

2.5 DT對HSA構象的影響

2.5.1 同步熒光測定同步熒光光譜根據熒光發色團的最大發射波長處微環境的變化信息可以判斷蛋白質的構象變化[12,13]。固定HSA濃度，增加DT含量，Δλ=15 nm時HSA中酪氨酸殘基的熒光猝滅程度較小(KSV=2.20×102L·mol-1)，峰位不變；Δλ=60 nm時色氨酸殘基最大峰的熒光強度顯著降低(KSV=1.16×104L·mol-1)，且略有藍移。這說明DT與HSA的結合位點更偏向色氨酸殘基。

2.5.2 三維熒光光譜通過三維熒光光譜等高圖，建立HSA及DT-HSA體系完整信息的指紋圖譜(圖3)。峰1是HSA中肽鏈羰基骨架的特征峰，峰2反映HSA的生色團Trp和Tyr殘基的光譜特性[18]。峰1峰頂坐標(λex/em,F)=(234/334,288.141)，峰2峰頂坐標(λex/em,F)=(283/336,421.031)。加入DT后，HSA的熒光峰峰1(234/328,184.648)藍移6 nm，峰2(283/334,371.381)藍移2 nm，其熒光強度分別降低了35.92%和11.79%。說明Trp和Tyr殘基所處微環境的極性減弱，疏水性增強，構象發生了變化。

圖3 HSA、DT-HSA的三維熒光等高線圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence contours of HSA and DT-HSA cHSA=1.0 μmol·L-1,cDT=13.1 μmol·L-1

2.5.3 傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜分析蛋白質在紅外區的特征吸收帶主要有蛋白質骨架C=O伸縮振動引起的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)及包含C-N伸縮和N-H彎曲振動耦合信息的酰胺Ⅱ帶[19]。FT-IR差譜圖(圖4a)顯示，在加入DT后，HSA的特征峰強度降低，酰胺I帶由1 640 cm-1移至1 572 cm-1，O-H伸縮振動峰移動相對微弱，這可能是由于DT和HSA分子間的C=O、O-H基團相互作用形成較強的分子間氫鍵[20]，破壞了HSA中維系原有二級結構穩定性的氫鍵，同時表明DT與HSA形成配合物中存在氫鍵。

酰胺Ⅰ帶包含不同的二級結構信息，對蛋白質研究更有價值。通過對酰胺Ⅰ帶的多次擬合(圖4b和4c)確定各子峰與不同二級結構的對應關系，可根據積分面積得到β-折疊(1 610～1 637 cm-1)、無規則卷曲(1 638～1 649 cm-1)、α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)、β-轉角(1 660～1 680 cm-1)和反β-折疊(1 680～1 700 cm-1)等HSA二級結構的含量。藥物DT與HSA作用后，β-折疊和α-螺旋含量分別由25.95%和41.88%下降至15.42%和27.37%，β-轉角、無規則卷曲及反β-折疊含量分別由14.53%、10.43%、7.21%增加到22.27%、23.64%和11.30%，而且總增加量和總降低程度基本相同。說明HSA與藥物作用后，其二級結構在內部發生轉化，對其構象產生了影響。

圖4 紅外(IR)差譜圖和酰胺Ⅰ帶高斯擬合圖Fig.4 IR difference spectrum and Gauss fitting graph of amide Ⅰ of HSA and DT-HSA system

2.5.4 圓二色(CD)譜法驗證HSA構象變化通過分析CD圖進一步證實了DT對HSA主鏈構象的影響[18]。從圖5可知，在208和217 nm處出現兩個負的特征肩峰，這是HSA中α-螺旋結構的特征峰。隨著與DT反應，特征峰強度升高，α-螺旋的含量由39.49%降至24.78%。說明DT通過與蛋白質主肽鍵結合，維持α-螺旋結構的氫鍵作用減弱，變為伸展的多肽，導致HSA的構象發生改變。

圖5 DT-HSA體系的圓二色譜圖Fig.5 CD spectra of DT-HSA

2.6 分子對接

通過分子模擬技術可以更直觀的了解藥物與HSA的結合位點和作用力類型。從圖6a和6b可看到，HSA有足夠空間與DT分子相互作用，藥物小分子周圍的疏水性殘基Ala291、Leu(238,219)和Trp214與DT中的甲基存在微弱的疏水作用，帶正電荷的His440、Arg(222,218)、Lys(444,195)殘基與DT分子中帶有孤對電子的羰基氧和苯環形成較強的范德華力；Pro447、Cys448、His440、Glu(188,294,292)和Asp451與小分子間存在氫鍵。

圖6c展示分子靜電表面，用藍色、紅色和白色代表正電荷、負電荷和中性殘基，分析發現DT分子周圍中性殘基較多，靜電作用存在的可能性較小。DT分子距離Trp214較Tyr452近，說明DT主要猝滅的是HSA中色氨酸的內源熒光，這與前文結論一致，也是對作用力研究的驗證和補充。

圖6 DT與HSA相互作用的分子模擬Fig.6 Molecular simulation of interaction between DT and HSAa.Molecular docking simulation and 3D diagram;b.Interaction 2D map;c.Electrostatic surface map.

2.7 輔酶對HSA及DT-HSA體系的影響

固定HSA與輔酶的濃度比為3∶1，加入不同濃度DT溶液，測定輔酶-HSA和輔酶-DT-HSA體系λex/λem=280/336 nm處的熒光強度，以探究輔酶對HSA及DT-HSA體系的影響。DT對HSA的熒光猝滅效率Q=[(F0-F)/F0]×100%，結果顯示，當輔酶單獨存在時，對HSA存在較強的熒光猝滅作用，其猝滅程度表現為VB2>CoA>VC>VE>VB1>GSH>CQ10，見表2。

表2 輔酶對DT與HSA相互作用的影響

分析表2中數據，發現輔酶-DT-HSA三元體系的動態猝滅常數Kq值數量級仍為1012，遠大于最大動態猝滅速率常數2.0×1010L·mol-1·s-1，說明輔酶的存在對猝滅機制沒有影響，仍為靜態猝滅；但三元體系的Ka和n都減小，其中VB2影響最大。輔酶對HSA的熒光猝滅效率Q越大，對DT與HSA的結合影響越大，7種輔酶對DT-HSA體系的影響與對HSA熒光猝滅程度的影響表現一致。表明輔酶優先占據結合位點，極大降低了DT與HSA的結合，縮短了DT在人體內的停留時間?？梢?，輔酶在人體中與藥物競爭結合，由此影響藥物的療效?；颊咴谟盟幤陂g應當合理安排膳食，以增強機體免疫力，在確保治療效果的同時降低藥物的副作用。

3 結論

在模擬生理條件下，DT與HSA的猝滅常數隨溫度的升高而降低，結合紫外光譜證實，DT對HSA內源性熒光的猝滅作用為靜態猝滅，用靜態猝滅雙對數公式計算得到DT與HSA的結合位點數n約等于1。DT-HSA的熱力學參數ΔH和ΔS均小于零，表明氫鍵和范德華力對維持配合物(1∶1)穩定性起重要作用，用分子對接技術進行驗證并補充，二者間也存在微弱的疏水力。DT與HSA的結合距離r約為1.48 nm，其主要結合位點位于HSA的亞結構域ⅡA site Ⅰ。nH≈1表明在HSA的結合位點處，藥物分子間幾乎不存在協同效應。

同步熒光光譜、三維熒光光譜、紅外光譜和圓二色譜表明，DT使HSA中Trp殘基微環境極性減弱，α-螺旋結構含量減小，構象發生改變。輔酶與DT形成競爭，對DT與HSA的結合有抑制作用，但不影響其猝滅機制。