基于網絡藥理學的葦莖湯治療非小細胞肺癌的作用機制研究

謝飛宇，毛 昀，褚雪鐳，蔡亞芳，薛 鵬，朱世杰

（1.北京中醫藥大學研究生院，北京 100029；2.中國中醫科學院望京醫院腫瘤科，北京 100102）

肺癌是全球死亡率最高的腫瘤，其中約85%的肺癌患者的病理類型為非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）［1］。隨著對NSCLC 病、生理機制研究的深入，治療方式也取得巨大突破，內科治療手段可歸納為：化療、靶向治療、免疫治療［2］。但是，NSCLC 的總體5 年生存率仍較低，因此，探索新的疾病靶點及藥物組合對于治療NSCLC 具有重要意義［3］。中醫藥在我國腫瘤治療領域有著廣泛的應用，在改善癥狀、處理并發癥、減毒增效、提高患者生存活質量等方面發揮著關鍵作用［4］。目前，多種中成藥已被證實治療NSCLC 有效，如華蟾素［5］、斑蝥［6］等。中醫藥成分豐富，參與調控的靶點、通路眾多，因此探索中藥在治療NSCLC 中的作用機制意義深遠。

葦莖湯見于孫思邈所著《備急千金要方》，由葦莖、桃仁、薏苡仁、冬瓜子四藥組成。其中葦莖甘寒輕浮，善清肺熱，《本草逢原》謂其“專于利竅，善治肺癰”，故為君藥。冬瓜子清熱化痰，利濕排膿，能清上徹下，肅降肺氣，與葦莖配合則清肺宣壅，滌痰排膿；薏苡仁甘淡微寒，上清肺熱而排膿，下利腸胃而滲濕，二者共為臣藥；桃仁活血化瘀，是為佐藥。四藥合用，共奏清熱化痰，逐瘀排膿之功。目前，葦莖湯被用于治療非小細胞肺癌及相關并發癥如上腔靜脈綜合征、惡性胸腔積液等［7，8］。但是，關于葦莖湯治療NSCLC 的活性成分和分子學作用機制尚未完全明確，有待進一步探索。

網絡藥理學作為一門新興技術，融合了計算機虛擬計算、高通量組學數據分析、多種數據庫檢索等手段，通過多層次網絡闡明藥物的化學成分及作用機制，為研究藥物與疾病開拓了新的視角［9］。本研究通過檢索TCMSP、Swiss Target Prediction、OMIM、Drugbank、TTD 等公共數據庫，篩選出葦莖湯的有效活性成分及潛在作用靶點，分析其治療NSCLC 的關鍵靶點、生物進程與信號通路，為后續進一步的體內外實驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 葦莖湯活性成分的收集與篩選

通過傳統中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）并結合檢索CNKI 數據庫、Pubmed 數據庫中的相關文獻，獲得葦莖、桃仁、薏苡仁、冬瓜子四藥的化學成分。再將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性指數（drug‐like index，DL）≥0.18 作為進一步篩選的依據。

1.2 葦莖湯活性成分靶點的預測及“中藥‐活性成分‐靶點”網絡圖的構建

利用TCMSP 數據庫獲取葦莖湯中篩選出的每個活性成分對應的潛在靶點信息，對于沒有靶點的成分在PubChem 數據庫輸入這些成分的InChIKey號碼，下載它們的2D 結構簡式SDF 文件，上傳至Swiss Target Prediction 進行預測，并選取Probabili‐ty 值≥0.7 的高置信度靶點。借助Uniprot（http：//www.uniprot.org）數據庫中的UniprotKB 功能，將篩選出的靶點全部校正為標準基因名。刪去沒有作用靶點的成分，運用Cytoscape3.7.2 軟件構建“中藥‐活性成分‐靶點”網絡圖。

1.3 非小細胞肺癌靶點的挖掘

將“non‐small cell lung cancer”作為關鍵詞在以下4 個數據庫中進行檢索，獲得NSCLC 靶點的信息：（1）OMIM 數據庫（https：//www.omim.org/）；（2）DrugBank 數據庫（http：//www.drugbank.ca/）；（3）GeneCards 數據庫（http：//www. genecards.org/），選取前100 個高相關度的靶點；（4）TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）。將所得的靶點進行標準化去重。

1.4 葦莖湯治療NSCLC 的靶點映射

通過在線繪圖軟件Venny2.1（https：//bioin‐fogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），制作韋恩圖，將葦莖湯所預測的靶點與NSCLC 所對應的靶點進行映射，獲取葦莖湯治療NSCLC 的關鍵作用靶點。

1.5 交集靶點蛋白與蛋白相互作用網絡分析

將葦莖湯和NSCLC 的交集靶點輸入在線STRING11.0 數據庫（https：//string‐db.org/），以置信度蛋白質參數＞0.7 為條件進行篩選，去掉網絡中的孤立節點。將所獲得的tsv 格式文件導入Cyto‐scape3.7.2 軟件進行可視化分析。同時，借助軟件中Molecular Complex Detection（MCODE）插件，對相關靶標數據進行分析，得出葦莖湯治療NSCLC 的核心靶點。

1.6 交集靶點的GO/KEGG 富集分析

利用Cytoscape3.7.2 軟件中的Clue GO 插件進行GO/KEGG 通路富集分析。其中，GO 富集分析可以表明基因靶點分子功能、細胞成分、生物進程。KEGG 分析可體現葦莖湯治療NSCLC 所涉及的靶點信號通路富集情況，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 葦莖湯主要活性成分

以OB≥30%、DL≥0.18 為篩選標準，經標準化去重后總共篩選出33 個有效成分，其中葦莖3 個，桃仁23 個，薏苡仁9 個，冬瓜子2 個，結果見表1。阿魏酸雖不符合篩選標準，因具有抗腫瘤活性，因此納入。

表1 葦莖湯主要活性成分Tab 1 The main active components of Weijing decoction

2.2 葦莖湯活性成分的靶點預測及靶點網絡圖構建

借助TCMSP、PubChem、Swiss Target Predic‐tion、Uniprot 數據庫，共得到葦莖湯活性成分的靶點85 個。運用Cytoscape3.7.2 軟件構建“中藥‐活性成分‐靶點”網絡圖，見圖1。

圖1 中藥‐活性成分‐靶點網絡圖Fig 1 The network of drugs-active components-targets

2.3 NSCLC 疾病靶點的獲取及葦莖湯治療NSCLC 靶點映射

以“non‐small cell lung cancer”為關鍵詞檢索OMIM、DrugBank、GeneCards、TTD 數據庫，通過標準化去重后共獲得NSCLC 相關靶點619 個。通過韋恩圖將葦莖湯所預測的靶點與NSCLC 的靶點進行映射，發現共有54 個交集靶點，即葦莖湯治療NSCLC 的關鍵作用靶點，見圖2。

圖2 葦莖湯‐NSCLC 共同靶點數Fig 2 The number of intersection targets of Weijing decoction-NSCLC

2.4 蛋白質‐蛋白質相互作用信息（PPI）網絡構建及核心靶標篩選

結合Cytoscape3.7.2 與STRING11.0 數據庫所獲得的tsv 文件，構建交集靶點的PPI 網絡圖，見圖3；通過MCODE 插件進行聚類分析，篩選網絡圖中核心靶點，見圖4。連接度（Degree）表示某點與某點連接的邊的數目，其值越大，表明該靶點在網絡中越重要，在圖中所對應的圓圈越大，顏色越深。綜合評分用來衡量靶點之間的聯系，其值越大，在圖像上表現為連線越粗，顏色越深，說明靶點之間聯系越緊密。

圖3 葦莖湯治療NSCLC 交集靶點蛋白質相互作用網絡圖Fig 3 PPI of intersection targets in the treatment of NSCLC with Weijing decoction

圖4 葦莖湯治療NSCLC 核心靶點蛋白質相互作用網絡圖Fig 4 PPI of hub genes in the treatment of NSCLC with Weijing decoction

2.5 GO 富集分析結果

葦莖湯治療NSCLC 主要涉及99 個生物進程，見圖5。這些生物進程主要與細胞凋亡、細胞核活動、血管調節方面相關。富集分析較集中的生物學過程有：外源性凋亡信號傳導（extrinsic apoptotic signaling pathway）、凋亡信號通路中半胱氨酸型內肽酶活性的激活（activation of cysteine‐type endo‐peptidase activity involved in apoptotic signaling path‐way）、凋亡信號通路中線粒體外膜通透性的正調控（positive regulation of mitochondrial outer membrane permeabilization involved in apoptotic signaling path‐way）、核受體活動（nuclear receptor activity）、血管直徑的正向調節（positive regulation of blood vessel di‐ameter）。

圖5 葦莖湯治療NSCLC 關鍵交集靶點GO 分析Fig 5 GO analysis of the key intersection targets of Weijing decoction in the treatment of NSCLC

2.6 KEGG 富集分析結果

對葦莖湯治療NSCLC 關鍵靶點進行KEGG 富集分析，共確定49 條相關信號通路，主要涉及腫瘤、細胞凋亡、炎癥、抗血管生成、代謝等方面，富集排名靠前的通路主要有腫瘤相關通路、乙型肝炎信號通路、p53 信號通路、細胞凋亡信號通路、VEGF 信號通路、糖尿病并發癥的AGE‐RAGE 信號通路等，見圖6。

圖6 葦莖湯治療NSCLC 關鍵交集靶點KEGG 分析Fig 6 KEGG analysis of the key intersection targets of Weijing decoction in the treatment of NSCLC

3 討論

現代醫學對于NSCLC 發生、發展的機制研究取得了重大突破，主要集中在驅動基因突變、抗血管生成、免疫治療等方面。表皮生長因子受體(EG‐FR）突變是NSCLC 中最常見的驅動基因突變，約見于27% 的肺腺癌患者及9% 的肺鱗癌患者［10］。EGFR 與活化的配體相結合形成二聚體，通過酪氨酸激酶殘基的磷酸化激活下游信號通路，參與細胞增殖、生存、侵襲、血管生成［11］。PD‐1 受體是表達在T 細胞表面的具有免疫抑制功能的受體，可與腫瘤細胞分泌的PD‐L1 相結合，使得T 細胞無法識別殺傷腫瘤細胞，引起腫瘤免疫逃逸［12］?；诖?，NSCLC 的內科治療方案也產生了較大變化，從以鉑類藥為基礎的雙藥化療為主，發展成化療、靶向治療、免疫治療多方案聯合的格局。雖然上述方案取得顯著療效，但仍面臨著5 年生存率較低、易產生耐藥性和受益人群較窄的問題。古代中醫典籍中雖然沒有對肺癌的記載，但根據本病的臨床表現，肺癌與“咳嗽”、“肺痿”、“肺積”、“息責”、“肺癰”等具有共通之處。流行病學表明，吸煙是肺癌最大的危險因素之一［13］，煙毒長期熏蒸肺臟，耗傷陰液，煉津成痰，痰聚化火，進一步耗傷氣陰，損傷肺絡，導致痰瘀互結［14］。根據清代《醫門補要》言：“表邪遏伏于肺，失于宣散，并嗜煙酒，火毒上熏，久郁熱熾，爍腐肺葉”；《雜病源流犀燭·積聚癥瘕痃癖痞源流》記載：“邪積胸中，阻塞氣道，氣不得通，為痰，為食，為血，皆邪正相搏，邪既勝，正不得制之，遂結成形而有塊?！?，進一步佐證了肺癌的核心病機為痰瘀互結，火毒熏肺。而葦莖湯不僅擅長清熱排膿，葉天士在運用此方時取其行氣、活血、逐瘀之功［15］?；诖?，葦莖湯可有效治療NSCLC，但其作用機制尚未明確。

本研究篩選出葦莖湯的有效成分，構建有效成分與靶點的網絡圖發現四味中藥的主要成分為β‐谷甾醇、豆甾醇、金色酰胺醇酯、阿魏酸。其中，豆甾醇為蘆根、薏苡仁、冬瓜子共同成分。該4 種成分均被證實具有抗腫瘤作用，如金色酰胺醇酯、阿魏酸可顯著抑制肺癌細胞A549 生長［16］。有研究發現從植物中提取的豆甾醇、β‐谷甾醇可以在不損傷正常肺組織細胞的同時，對人肺腺癌細胞A549 有著較強的抑制作用［17，18］。此外，β‐谷甾醇可以與小腸刷狀緣酶競爭，降低機體對膽固醇的吸收，從而降低肺癌的發生風險［19］。Vundru 等［20］發現，β‐谷甾醇可通過下調人肺腺癌A549 細胞中CDK4、細胞周期蛋白D1 的表達水平，上調p21/Cip1 和p27/Kip1 蛋白的表達，將細胞周期阻滯于G0∕G1期，從而誘導人肺腺癌A549 細胞的凋亡。

通過String、Cytoscape3.7.2 軟件MCODE 插件構建葦莖湯治療非小細胞肺癌的蛋白互作網絡，結果發現 EGFR、JUN、TNF、MAPK8、CASP3、HSP90AA1、JAK2、PTGS2 是治療非小細胞肺癌的核心靶點。EGFR 又稱表皮生長因子受體，是酪氨酸激酶受體ErbB 家族的4 個成員之一?；蛲蛔兛蓪е?EGFR 異?；罨?，從而啟動 EG‐FR‐Ras‐Raf‐MEK‐ERK 和PI3K/Akt 信號通路引起腫瘤細胞的異常增殖［21］。EGFR 突變廣泛見于非小細胞肺癌患者，使用針對EGFR 突變的靶向藥物進行治療也取得顯著療效［22］。相關研究表明，葦莖湯可以延長肺癌Lewis 小鼠的生存期，并下調其腫瘤組織中EGFR 的表達［23］。HSP90AA1 為熱休克蛋白家族成員，該家族在惡性腫瘤細胞的增殖、分化、遠處轉移中發揮關鍵作用，且在NSCLC 患者中高度表達［24］。相關研究表明，HSP90 抑制劑17‐AAG可誘導人肺癌A549 及H446 細胞的凋亡［25］。JAK2是Janus 激酶家族的成員，可激活特定STAT（信號轉導子和轉錄活化子），調控基因的轉錄［26］。JAK/STAT 信號通路被認為與非小細胞肺癌的發生、轉移、耐藥機制的形成密切相關［27‐29］。姜澤群等［30］通過檢測Lewis 肺癌原位移植小鼠腫瘤組織lncRNA、mRNA 的水平，發現葦莖湯干預組小鼠下調的靶基因顯著富集于JAK/STAT 信號通路，提示葦莖湯可能通過抑制JAK/STAT 信號通路來治療非小細胞肺癌。

GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析的結果顯示，葦莖湯治療非小細胞肺癌的作用機制主要涉及細胞凋亡、p53、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路。細胞凋亡信號通路主要分為內源性與外源性兩種，二者相對獨立，又交互作用。研究證實，當發生內源性細胞凋亡時，缺血、缺氧等病理因素首先引起線粒體膜滲透性改變，并使線粒體釋放凋亡相關蛋白，如線粒體細胞色素c，介導細胞進一步的凋亡［31］。外源性細胞凋亡途徑多指由膜死亡受體所介導的凋亡途徑。死亡配體能與相應死亡受體相結合，形成三聚體，多聚化的死亡受體的死亡結構域發生改變，從而與其他接頭蛋白進行結構域同源配對結合，形成死亡誘導信號復合體，進一步誘導細胞凋亡［32］。相關研究表明，p53 是NSCLC 中突變率最高的基因之一，而p53 作為轉錄因子，可促進凋亡相關基因如Bax、Fas 等的表達上調，并通過這些蛋白參與線粒體介導的和死亡受體介導的凋亡途徑［33］。而不論是死亡受體介導的凋亡途徑所激活的caspase‐8、caspase‐10，還是線粒體介導的凋亡所激活得caspase‐9，均可水解激活caspase‐3、‐6和‐7 從而引發下游caspase 級聯反應，通過滅活凋亡抑制因子、激活促凋亡因子Bid、直接降解細胞骨架相關蛋白三條途徑引起腫瘤細胞凋亡［34］。葦莖湯中的多種成分可參與誘導腫瘤細胞凋亡，Rajavel等［35］發現桃仁所富含的β‐谷甾醇可以顯著上調Cas‐pase 3、9 以及p53 的表達水平，可通過內、外源性凋亡途徑誘導肺腺癌A549 細胞凋亡；此外吳競等［36］使用葦莖主要成分阿魏酸干預裸鼠肺癌A549 模型，發現阿魏酸可以上調Caspase‐3 蛋白的表達，降低mTOR 的水平，激活細胞凋亡與自噬進程，抑制腫瘤細胞生存。

腫瘤新生血管活躍在NSCLC 的發展中發揮著關鍵作用，VEGF 可在缺氧誘導因子（HIF‐α）等的活化作用下，與VEGFR 結合，激活PI3K‐AKT、MAPK 信號通路促進腫瘤血管的增殖［37］。目前，VEGF‐A 抑制劑貝伐珠單抗已被FDA 列為NSCLC 非鱗狀細胞癌在無驅動基因突變的一線用藥。周珊珊等［38］通過細胞實驗證實，同樣富含β‐谷甾醇的大黃可以降低腎小管上皮細胞中VEGF 蛋白的表達水平。除此以外，VEGF 還參與了腫瘤免疫抑制微環境的形成，促使腫瘤發生免疫逃逸［39］。相關研究表明，Treg 細胞是一類具有免疫抑制功能的T 細胞亞群，VEGF 對Treg 具有趨化作用，在小鼠黑色素瘤模型中發現，NRP1 在Foxp3+Treg 中高表達，腫瘤細胞自分泌的VEGF 作為趨化因子，可以引導Treg 浸潤腫瘤組織，從而負向調控抗腫瘤免疫效應［40］。而一項臨床試驗表明，葦莖湯可以明顯降低重癥肺炎患者CD4+CD25+Treg 細胞數目，差異較對照組有統計學意義（P<0.05）［41］。因此，筆者預測葦莖湯可能通過減少Treg 細胞的數目來改善NSCLC 免疫抑制微環境。

綜上所述，葦莖湯可能作用于Caspase‐3、Caspase‐8、Caspase‐9、p53、VEGF 等關鍵靶點，通過調節細胞凋亡通路、p53 信號通路、VEGF 通路以及下調Treg 細胞表達來治療NSCLC。本研究仍存在一些局限，如藥物成分與靶點之間的作用、葦莖湯對免疫微環境的調節，尚需進一步實驗證明。