電針“神門”對急性心肌缺血模型大鼠心肌和海馬組織以及血清中cAMP 和cGMP 表達的影響

趙麗娜，蔣志明，吳立斌，王敏君，魏小桐，張 帆，崔海玲，王 潔，2，吳子建，2

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院針灸經絡研究所，安徽 合肥 230038）

心血管疾病發病率和死亡率高，目前中國的心血管病患病率仍然處于不斷上升狀態，死亡率仍居首位，是我國居民死亡的主要原因之一［1-3］。心肌缺血可造成局部的缺血性心肌損傷，逐漸增加心血管疾病負重［4，5］，影響海馬齒狀回神經分化，還可引起海馬區的認知功能障礙［6］，導致心臟與大腦的損傷。第二信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos‐phate，cAMP）和環磷酸鳥苷（cyclic guanosine mono‐phosphate，cGMP）通過信號轉導參與細胞調控生理過程［7，8］，對于心血管相關疾病的發生也有著重要的作用［9，10］。

前期研究發現電針對急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）大鼠心肌具有保護作用，其機制與下丘腦、海馬等中樞調控區域有密切關系［11，12］，且與血清中效應物質及多種神經遞質有關［13，14］，但是否對血清、心肌和腦組織中cAMP 和cGMP 有影響尚不清楚。本研究在前期工作的基礎上，通過觀察急性心肌缺血模型大鼠電針后心肌和海馬組織及血清中cAMP 和cGMP 的水平變化，探討電針神門對急性心肌缺血致心腦損傷的效應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

普通級健康雄性SD 大鼠30 只，購于安徽省實驗動物中心，許可證號：scxk（魯）20190003，體質量220～240 g，同條件常規飼養在康為IR 60 籠具中，溫度（25±5）℃，適應性喂養7 d。將大鼠隨機分為正常組、模型組和電針組，心電圖異常和模型復制失敗者剔除，最終每組納入6 只進行統計分析。實驗全程嚴格遵守中華人民共和國科技部2006 年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 實驗儀器及試劑

1.2.1 實驗儀器 Powerlab 8 導生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments 公司）；華佗牌電針儀（蘇州醫療用品廠有限公司，SDZ-療型）；電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司，BSA124S）；高速臺式冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司，Sor‐vall ST 16R）；微量移液器（德國Eppendorf 公司）；微生物培養箱（上海一恒科學儀器有限公司，DHP-9031）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，Spectrophotometer）；一次性使用針灸針（0.25 mm×25 mm，蘇州天協針灸器械有限公司）。

1.2.2 實驗試劑 水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，Z10M10Y86931）；大鼠肌鈣蛋白T（Tn-T）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060010）；大鼠肌鈣蛋白I（Tn-I）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060007）；大鼠環磷酸腺苷（cAMP）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060015）；大鼠環磷酸鳥苷（cGMP）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060021）。

1.3 模型復制及評價方法

大鼠常規普通飼料飼養，模型復制前記錄大鼠肢體標準Ⅱ導聯心電圖。參照文獻［15，16］，通過結扎心臟冠狀動脈左前降支復制急性心肌缺血模型。大鼠用10%水合氯醛溶液，按3 mL/kg 劑量麻醉后仰臥固定，備皮，皮膚用碘伏消毒滅菌，剪開胸骨左緣胸前皮膚，彎頭止血鉗鈍性分離第2、3、4 肋處的胸前肌肉組織，待看到心臟陰影，撐開肋骨，暴露心臟于胸腔外，用6-0 號醫用帶線縫合針快速在心臟的冠狀動脈左前降支中下部進行結扎，之后將心臟迅速送回胸腔，擠出胸腔內的空氣，止血鉗加緊胸部皮膚，防止氣胸，3-0 號縫合線縫合胸部皮膚。模型復制過程中全程記錄大鼠肢體標準Ⅱ導聯心電圖，以T 波高聳或者倒置表示為心肌缺血模型復制成功。

1.4 穴位選擇與刺激方式

參考《實驗針灸學》［17］常用實驗動物的針灸穴位定位方法，“神門”穴定位在前肢內側腕部橫紋尺骨邊緣。從模型復制后第2 天開始，大鼠在不予其他任何處理情況下固定在特制裝置中，暴露四肢，在雙側“神門”穴及后方1 mm，各刺入一針灸針，刺入深度1～2 mm，連接電針儀，電流頻率為2 Hz，強度以大鼠爪部輕微抖動為度，每次電針15 min，1次/d，連續電針7 d。正常組和模型組大鼠不予電針。

1.5 檢測指標及實驗方法

1.5.1 心電圖監測與分析 針形電極分別插入大鼠左下肢、右下肢、右上肢皮下，采用Powerlab 8 導生理記錄儀采集大鼠標準Ⅱ導聯心電信號，通過chart 5 軟件系統內置ECG analyze 模塊進行分析。

1.5.2 心肌、海馬組織及血清的收集與處理 模型組大鼠于模型復制后，電針組大鼠于末次電針治療后，用10%水合氯醛溶液，按3 mL/kg 劑量麻醉后剖腹取腹主動脈血，4 ℃靜置1 h，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，取上清分裝；冰上剪取左心室部位心肌組織，快速取下海馬組織，各稱取50 mg 樣本于玻璃勻漿器中，加入450 μL PBS 溶液充分勻漿，移至EP管中，4 ℃、3 000 r/min 離心20 min，取上清分裝。所有樣品?80 ℃冰箱保存待測。

1.5.3 ELISA 檢測 心肌、海馬組織和血清中肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T 和cAMP、cGMP 的水平取收集的待測樣品冰上緩慢溶解，采用酶聯免疫分析法（en‐zyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠心肌組織和血清中肌鈣蛋白I（troponin I，cTn-I）和肌鈣蛋白T（troponin T，cTn-T）的水平以及心肌、海馬組織和血清中cAMP 和cGMP 的水平。分別于酶標板中加入標準品和樣品，每孔加入酶標試劑100 μL，37 ℃溫育1 h，用醫用洗滌液洗酶標板5次，拍干，加入顯色劑各50 μL 混勻，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μL，酶標儀450 nm 波長處測量各孔的吸光度（OD）值。實驗過程嚴格遵循試劑盒說明的操作方法及注意事項進行。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠心電圖改變比較

以Powerlab 8 導生理記錄儀記錄大鼠AMI 模型復制前后以及電針治療7 d 后心電圖，觀察ST 段的高度以判斷模型復制成功與否。模型復制后ST段的高度明顯上升，表示模型復制成功，電針治療后ST 段下降，心肌缺血狀態明顯改善。見圖1。

圖1 大鼠心電圖改變的比較Fig 1 Comparison of ECG changes in rats

2.2 電針組大鼠心電圖ST 高度的比較

與模型復制前相比，模型復制后的ST 高度明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.01）；與模型復制后相比，電針治療后的ST 高度明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。見表1、圖2。

圖2 大鼠ST 高度比較Fig 2 Comparison of ST height in rats

表1 大鼠ST 高度比較（mV，n=6，±SEM）Tab 1 Comparison of ST height in rats（mV，n=6，±SEM）

表1 大鼠ST 高度比較（mV，n=6，±SEM）Tab 1 Comparison of ST height in rats（mV，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

組別模型復制前模型復制后電針治療后ST height 0.131 5±0.018 0.494 3±0.044**0.076 2±0.050##F P<0.000 1<0.000 1 32.53

2.3 各組大鼠心肌組織和血清cTn-I 和cTn-T 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織cTn-I 和cTn-T 的水平均明顯降低，血清中cTn-I 和cTn-T的水平均顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠心肌組織cTn-I 和cTn-T 的水平均有所升高，血清cTn-I 和cTn-T 的水平均明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01）。見表2、表3、圖3。

圖3 大鼠心肌組織和血清cTn-I 和cTn-T 水平比較Fig 3 Comparison of cTn-I and cTn-T content in myocardium and serum of rats

表2 大鼠心肌組織和血清中cTn-I 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 2 Comparison of cTn-I content in myocardium and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表2 大鼠心肌組織和血清中cTn-I 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 2 Comparison of cTn-I content in myocardium and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，**P<0.01 與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

項目F P血清51.07<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.026 7心肌組織組別正常組模型組電針組正常組模型組電針組cTn‐I 703.7±37.58 1 416±86.15**654.2±42.78##1 470±65.37 1 123±21.33**1 292±16.42#18.10

表3 大鼠心肌組織和血清中cTn-T 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 3 Comparison of cTn-T content in myocardium and serumof rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表3 大鼠心肌組織和血清中cTn-T 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 3 Comparison of cTn-T content in myocardium and serumof rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

項目F P血清86.490<0.000 1<0.000 1 0.034 7 0.042 4心肌組織組別正常組模型組電針組正常組模型組電針組cTn-T 135.40±5.50 480.80±31.31**154.70±17.22##389.70±8.01 353.50±11.07*388.40±8.15#4.966

2.4 各組大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織cAMP 水平明顯升高，海馬組織和血清cAMP 的水平降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠心肌組織cAMP 水平降低，海馬組織和血清cAMP 的水平升高，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01）。見表4、圖4。

圖4 大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平比較Fig 4 Comparison of cAMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats

表4 大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 4 Comparison of cAMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表4 大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 4 Comparison of cAMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，**P1<0.01 與模型組比較，#P2<0.05，##P2<0.01。

項目血清心肌組織海馬組織正常組11.360±0.326 10.590±0.228 13.170±0.286模型組5.695±0.157**12.560±0.253**11.320±0.319**電針組9.749±0.350##11.590±0.201#12.420±0.216#F P1 P2<0.000 1<0.000 10.023 4 0.000 80.033 0 101.10 18.63 11.28<0.000 1

2.5 各組大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織和血清cGMP 的水平升高，海馬組織cGMP 的水平降低，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠海馬組織cGMP 水平升高，血清中cGMP 的水平明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01），心肌組織cGMP 水平的差異無統計學意義（P>0.05）。見表5、圖5。

表5 大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 5 Comparison of cGMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表5 大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 5 Comparison of cGMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，*P1<0.05，**P1<0.01；與模型組比較，#P2<0.05，##P2<0.01。

項目血清心肌組織海馬組織正常組6.213±0.184 15.460±0.347 18.040±0.227模型組11.160±0.216**17.050±0.419*16.300±0.245**電針組7.036±0.240##16.420±0.244 17.330±0.319#F P1 P2<0.000 1 0.013 60.414 4 0.001 00.392 0 152.500 5.399 10.670<0.000 1

圖5 大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平比較Fig 5 Comparison of cGMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats

3 討論

心肌肌鈣蛋白是診斷心血管疾病的生物標志物之一，cTn-I 和cTn-T 在臨床及醫學相關領域被視為評價心肌損傷程度的生物標志物［18，19］。研究表明肌鈣蛋白水平的升高與心血管疾病相關，肌鈣蛋白水平不僅具有評價心肌疾病的作用，其也可以用來評估臨床梗死及預后的嚴重程度［20，21］。在本研究中，模型組心肌組織中cTn-I 和cTn-T 的水平降低，血清中cTn-I 和cTn-T 的水平明顯升高，表示急性心肌缺血模型復制后造成心肌細胞損傷，導致心肌組織中cTn-I 和cTn-T 的釋放而降低，血清中cTn-I和cTn-T 的水平升高，電針后心肌組織肌鈣蛋白水平回升，血清中肌鈣蛋白水平明顯下降，這從心肌和血清中肌鈣蛋白的水平變化的角度判斷，證明了電針可以改善心肌缺血造成的心肌細胞損傷。

cAMP 和cGMP 是機體中重要的第二信使，接受細胞膜或細胞內受體的信號，通過信號轉導以調控生理過程［22］。cAMP 通過腺苷酸環化酶和蛋白激酶A 相互作用產生一系列反應，從而影響細胞功能［23，24］；cGMP 激活蛋白激酶G 等效應因子和核苷酸門控通道以調節肌力和代謝等生理病理過程［25-27］。cAMP 和cGMP 均可由磷酸二酯酶降解，其在機體水平的相對平衡與環核苷酸降解酶和磷酸二酯酶的活性有關，cGMP 與PDE2 特異性結構域的結合會變構地刺激酶的催化速率并導致cAMP濃度降低［28］。cAMP 和cGMP 通過相關激酶和肽等作用于機體，參與機體調節作用機制，在心臟的病理、生理功能方面發揮重要的作用［24，27］，cGMP 可以影響cAMP 信號的轉導進而影響心肌細胞的收縮力，心血管疾病的發生可能導致cAMP 和cGMP 水平的失衡［9，10，28］。本研究發現電針可以使大鼠心肌組織中升高的cAMP 水平降低，降低海馬組織和血清中升高的cAMP 水平，使血清中升高的cGMP 水平降低，刺激釋放cGMP 而使心肌受損后所致的海馬組織中降低的cGMP 水平升高，但對心肌組織中cGMP 水平變化幾乎沒有影響。電針治療后AMI所致的心肌損傷程度的改善，以及心肌、海馬組織和血清中cAMP 和cGMP 水平的改變，證明了電針“神門”穴改善AMI 所致的心肌細胞和海馬組織的損傷，可以通過調節大鼠心肌和海馬組織以及血清中cAMP 和cGMP 水平的變化，進而調節機體細胞的信號轉導以調控生理病理過程而發揮作用。

研究證實，電針可以通過釋放體液、心臟保護因子改善心肌缺血后的恢復，提高缺血心臟間充質干細胞的存活率，降低缺血性心臟病產生的對自主神經功能的損害［29，30］，激活腺苷受體改善心肌的缺血性損傷［31］，可通過調節AngⅡ-TGF-β1通路改善自發性高血壓所致的心肌纖維化［32］，從而降低心肌缺血導致的心腦損傷。既往研究也證實了電針手少陰經原穴神門穴可以通過影響心肌缺血大鼠海馬腦源性神經營養因子、調節下丘腦室旁核神經元活動、調節組織中HCN 通道蛋白及mRNA 的表達，起到對心肌缺血后心腦損傷的良好改善作用［16，33］。本研究在前期工作的基礎上，通過冠狀動脈結扎法復制心肌缺血模型，電針治療前后心電圖的改變以及心肌組織和血清中cTn-I 和cTn-T 水平的變化證實了模型復制的可靠性和電針神門穴改善心肌損傷程度的有效性；通過研究心肌和海馬組織以及血清中cAMP 和cGMP 的水平變化，證明了電針“神門”能顯著改善AMI 致心腦損傷的模型大鼠血清和海馬的cAMP、cGMP 以及心肌cAMP 的表達，但對心肌cGMP 的影響較小。說明了電針“神門”穴改善AMI 后心腦損傷的作用可能與心肌、海馬組織和血清中第二信使cAMP 和cGMP 水平的變化相關，從而調節機體細胞的信號轉導以調控生理病理過程。

本文探討了電針“神門”對AMI 模型大鼠心腦損傷可能保護作用的分子機制，為神門穴的臨床應用提供參考依據，但是電針“神門”穴如何參與調控心肌、海馬組織及血清中cAMP 和cGMP 的作用機制尚需進一步研究。

作者貢獻度說明：

趙麗娜：主要負責本研究的構思、設計、數據的分析和稿件的撰寫，參與了全部實驗過程，蔣志明和吳立斌：參與了動物模型的復制以及取樣，王敏君、魏小桐、張帆和崔海玲：參與了動物的電針以及取樣，王潔：參與了本研究數據的分析指導及討論，吳子建：參與了實驗及稿件的分析指導、評估和修訂工作。