基于網絡藥理學探討夏枯草對Graves 病的作用機制

李 俊，魏軍平

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053）

甲狀腺功能亢進癥是由于甲狀腺激素分泌過多而引起的循環、神經、消化系統等興奮性增高和代謝亢進為主要特征的臨床綜合征，其中80%是由Graves ?。℅raves' disease, GD）引起的。甲亢流行病學因診斷閾值、測定方法及碘營養狀況的差異而不同[1]。歐洲的一項薈萃分析表明患病率約為0.8%，美國調查顯示為1.3%，而我國的患病率約為0.8%[2,3]。GD 是常見的器官特異性自身免疫疾病之一，甲狀腺刺激性抗體是其特征性致病抗體，存在于90%以上的病人。除自身免疫因素以外，碘營養狀況、心理壓力、性別、吸煙、硒、免疫調節劑等也可能導致疾病的發展[4‐6]。甲亢的主要治療方法是抗甲狀腺藥物、放射性碘和手術，在美國以外地區首選ATD 作為主要治療方法，但對于持續性或復發性甲亢患者，應使用手術和放射性碘?？辜谞钕偎幬锟梢种萍谞钕偌に氐暮铣?，但緩解率較低、容易復發。放射性碘和手術見效快，但甲狀腺功能減退、甲狀旁腺功能減退、喉返神經損傷等副作用常見，故臨床應用受限。中藥治療GD 具有特殊優勢，在調節機體免疫的同時可以可減少抗甲狀腺藥物所致肝功能異常等毒、副作用，降低復發率和甲減發生率[7]。夏枯草(Prunella vulgaris)味辛、性苦寒，歸肝膽經，功能清熱瀉火、明目、散結消腫等，常用以治療瘰疬、癰腫、眩暈頭痛等。藥理研究表明其具有降壓、降糖、抗菌消炎、免疫抑制、清除自由基及抗氧化、抗腫瘤、抑制病毒生長等多種作用[8]。不少臨床研究表明夏枯草制劑與西醫治療相結合可有效降低抗體水平、調節異常免疫功能并改善甲狀腺功能，但其臨床作用機制尚未完全明確[9，10]。網絡藥理學是基于系統生物學理論，通過網絡的構建及分析，選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科[11]。本研究通過網絡藥理學的方法，收集夏枯草的治療GD 的有效成分、探究其治療GD 的作用靶點及機制，為夏枯草治療GD 的臨床研究提供新的理論依據。

1 材料與方法

中草藥系統藥理學平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）；DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/）；GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）；STRING 數據庫（https：//string‐db.org/）；PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）；DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.6.1軟件；PyMOL 2.3.2軟件；AutoDock‐Tools 1.5.6軟件；AutoDock Vina 1.1.2軟件。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分及靶點篩選 從TCMSP 平臺通過檢索并獲取夏枯草的相關化學成分［12］。根據ADME 特性對所獲取的化學成分進行篩選，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為條件，篩選出符合條件的化學成分［13，14］。同時應用TCMSP 獲取相關成分的靶點，并通過Uniprot 數據庫將相關靶點蛋白轉換為標準基因。

1.2.2 Graves 病相關靶點獲取 同時檢索Gene‐Cards 數據庫及DisGeNET 數據庫數據庫，獲取GD相關的疾病靶點。將兩個數據庫中所得靶點結果合并去重，并將最終所得靶點名標準化。將夏枯草作用靶點與GD 疾病靶點二者取交集，得到夏枯草治療的GD 的關鍵靶點。

1.2.3 構建“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡 使用Cy‐toscape 軟件構建“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡。以藥物、藥物活性成分、疾病、疾病靶點為節點，通過Excel 表格構建相應關系。然后將表格導入Cyto‐scape 軟件中繪制“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡圖，觀察夏枯草活性成分與疾病靶點之間的相互作用，確定網絡中的關鍵成分和關鍵靶點［12］。

1.2.4 構建關鍵靶點的蛋白互作網絡 將夏枯草治療GD 的關鍵靶點數據導入STRING 數據庫，構建夏枯草治療GD 的蛋白‐蛋白互作網絡（protein protein interaction network，PPI network），分析關鍵靶點蛋白之間的作用關系。PPI 網絡中，各個節點的大小和顏色深淺反映其自由度（Degree）值的大小，其中Degree 值越大代表此節點在網絡中越重要。

1.2.5 GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析 將得到的夏枯草治療GD 的關鍵靶點導入DAVID 數據庫進行GO（gene ontology）生物學過程和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。以閾值P<0.05 為條件篩選排名靠前的生物學過程或通路，并使用R 語言繪圖使結果可視化。

1.2.6 分子對接驗證 從“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡中選取關鍵活性成分和PPI 網絡中的核心靶蛋白，在TCMSP 數據庫和PDB 數據庫分別下載成分及靶蛋白的結構文件。利用PyMol 軟件將靶蛋白的配體分離并去除水分子，然后將小分子成分和靶蛋白受體使用AutoDockTools 軟件處理并保存為相應格式文件。最后利用AutoDock Vina 軟件進行對接驗證，評價夏枯草關鍵活性成分與核心靶蛋白之間的對接情況。

2 結果

2.1 夏枯草化學成分及作用靶點

從TCMSP 數據庫中共檢索到的夏枯草的化學成分有60 個，依據ADME 特性對成分進行篩選（OB≥30%，DL≥0.18），符合條件的化學成分有11 個［13］，刪除無靶點信息的化學成分，最終獲取10個活性成分。見表1。在TCMSP 數據庫中查詢符合篩選條件的活性成分的作用靶點并去重，結果顯示有10 個成分一共作用于198 個靶點，最后使用Uniprot 數據庫將這些靶點蛋白轉換為對應基因。

表1 夏枯草化學成分篩選Tab 1 Selected active constituents of Prunella vulgaris from TCMSP

2.2 夏枯草治療GD 的靶基因篩選

同時使用GeneCards 及DisGeNET 數據庫檢索GD 的疾病基因。從GeneCards 數據庫中篩選得到靶基因1 467 個，將Relevance score≥20 的155 個納入研究。從DisGeNET 數據庫中篩選得到585 個靶基因，將兩個數據庫中檢索到的靶基因合并去重后共得到靶基因646 個。比對夏枯草作用靶點基因與GD 疾病靶基因，共篩選出二者的交集靶基因57 個并用于后續分析，見圖1。

圖1 夏枯草化學成分作用靶點與Graves病疾病靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the targets of Prunella vulgaris chemical components and the disease targets of Graves disease

2.3 “藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡的構建

為了深入探究夏枯草的活性成分、作用靶點與疾病靶點之間的關系。通過Cytoscape 軟件構建“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡，見圖2。網絡中共有節點67 個，其中8 個節點代表活性成分，57 個節點代表疾病靶點，節點相互作用關系172 條。其中橢圓形代表GD，圓形代表GD 的靶基因，棱形代表夏枯草及其活性成分，節點之間的連線代表二者之間的相互作用。相連的節點數目越多，那么圖形的面積越大，顏色越深（橙色>淺黃色>淺綠色>淺藍色），意味著這個靶點或化合物越在這個網絡中的作用就越關鍵。以degree 值為篩選條件，得到槲皮素、木犀草素、山柰酚這3 個成分可能是夏枯草治療GD 的關鍵成分，見表2。

圖2 夏枯草治療Graves 病“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡圖Fig 2 "drug-component-disease-target" network diagram of the treatment of Gravse with Prunella vulgans

表2 夏枯草治療GD 的關鍵成分Tab 2 The key active components of Prunella vulgaris in treating GD

2.4 PPI 網絡的構建與分析

將上述的57 個關鍵靶點的數據導入STRING數據庫，從數據庫中導出相應數據并通過Cytoscape軟件中構建PPI 網絡圖，見圖3。該網絡共涉及57個靶點及688 條作用關系。圖中各節點隨著degree值由小到大，則節點面積逐漸增大、顏色逐漸加深，且節點越接近圓心。篩選出degree 值靠前的10 個靶點，預測這些靶蛋白可能是夏枯草治療GD 的核心靶點見表3。

圖3 夏枯草治療Graves 病PPI 網絡圖Fig 3 PPI network diagram of Prunella vulgaris treatment of Graves disease

表3 夏枯草治療GD 的核心靶點Tab 3 The key targets of Prunella vulgaris in treating GD

2.5 GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析

為了進一步探究夏枯草治療GD 的作用機制，對57 個關鍵靶點進行GO 生物功能注釋和KEGG信號通路分析［15］。GO 富集分析分為生物學過程、細胞組分及分子功能。從結果來看，夏枯草治療GD 的關鍵靶點主要涉及的生物過程有：一氧化氮生物合成過程的正調控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、炎癥應答（inflammatory response）、對乙醇的反應（response to ethanol）、衰老（aging）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（posi‐tive regulation of transcription from RNA poly‐merase Ⅱpromoter）、凋亡過程的負調控（negative regulation of apoptotic process）、藥物反應（response to drug）、基因表達的正調控（positive regulation of gene expression）；主要存在于細胞外間隙（extracel‐lular space）、胞外區（extracellular region）、質膜外側（external side of plasma membrane）、線粒體（mito‐chondrion）等；主要參與細胞因子活性（cytokine ac‐tivity）、酶結合（enzyme binding）、同一蛋白結合（identical protein binding）等，見圖4。KEGG 通路分析結果表明夏枯草治療GD 的關鍵靶點涉及了TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、HIF‐1 信號通路（HIF‐1 signaling pathway）、癌癥相關通路（pathways in cancer） 、PI3K‐Akt 信 號 通 路（PI3K‐Akt signaling pathway）、細胞因子‐細胞因子‐受體相互作用（cytokine‐cytokine receptor interac‐tion）、癌癥蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）等，見圖5。提示夏枯草可能通過調控上述信號通路發揮治療GD 的作用。

圖4 GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

圖5 KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

2.6 分子對接

選擇“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡中的關鍵活性成分槲皮素與PPI 網絡中3 個核心靶蛋白進行分子對接。在PDB 數據庫下載AKT1、IL‐6 及TNF的蛋白結構文件，采用Pymol 軟件去掉水分子和配體分子。再用AutoDockTools 軟件進行格式轉化并使用AutoDock Vina 軟件進行分子對接［16］，其中Full fitness 值越低，說明靶蛋白與小分子的結合越緊密，見表4。結果顯示，槲皮素與3 個靶蛋白均可對接，且槲皮素與AKT1 的對接效果最好（圖6），其次是槲皮素與IL‐6 的對接（圖7），最后是槲皮素與TNF 的對接結果（圖8）。故預測夏枯草中的槲皮素與疾病靶點AKT1 的相互作用在夏枯草治療GD 中發揮著重要作用。

圖6 槲皮素與AKT1 分子對接Fig 6 Molecular docking of quercetin and AKT1

圖7 槲皮素與IL‐6 分子對接Fig 7 Molecular docking of quercetin and IL-6

圖8 槲皮素與TNF 分子對接Fig 8 The docking of quercetin and TNF molecule

表4 分子對接結果Tab 4 Molecular docking results

3 討論

從“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡圖可知槲皮素、木犀草素、山柰酚等化學成分是整個網絡中的重要節點。槲皮素作為一種常見的黃酮類化合物，已證實是一種抗甲狀腺激素功能的物質，對甲亢和甲狀腺毒性作用有改善效果。在槲皮素抑制FRTL‐5 細胞的生長的實驗中，發現槲皮素可下調與甲狀腺合成相關的部分基因的表達，包括NIS、TSHR、TPO和TG等，動物實驗也表明槲皮素能夠抑制SD 大鼠體內碘的攝?。?7］。槲皮素能夠有效改善甲亢誘導的甲狀腺功能變化及肝臟脂質過氧化，提高SOD 和CAT 活性，并恢復肝臟D1 活性［18］。另一方面研究證實山奈酚、槲皮素等均能顯著增加D2 活性，上調D2 基因的表達并使局部T3 的生成增加，提高骨骼肌細胞氧氣及能量消耗［19］。木犀草素具有廣泛的抗炎作用，但尚缺乏木犀草素治療GD 的實驗研究。此外，“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網絡分析顯示，GD 的靶基因PPARG、PIK3CG、CASP9、AKT1、TNF、ICAM1、BCL2、BAX等與夏枯草活性成分相互作用較多，提示這些靶點是夏枯草治療GD 的潛在靶基因。GD 眼?。℅raves' ophthalmopathy，GO）中眼眶成纖維細胞向脂肪細胞的分化是過氧化物酶體增殖物激活受體G 依賴性過程，其對于GO 致病組織重塑至關重要［20］。細胞間黏附分子1（ICAM1）是是淋巴細胞功能相關抗原1（LFA1）分子的配體，在炎癥和免疫介導中具有重要作用。有研究發現高水平血清ICAM1 與自身免疫性甲狀腺疾病有關，且抗甲狀腺素過氧化物酶陽性的GD 患者的血清循環ICAM1 濃度明顯高于陰性的患者［21］。GD 患者甲狀腺濾泡周圍的毛細血管內皮細胞和具有單核細胞聚集病變的毛細血管內皮細胞中的ICAM1 表達增強，LFA1/ICAM1 通路可能是導致單核細胞遷移到GD 患者甲狀腺的原因［22］。細胞凋亡在多細胞生物的發育和內環境穩定中起重要作用，細胞凋亡與Graves 病甲狀腺實質的重塑有關，并與細胞增殖密切相關，凋亡的開始與細胞內聚力的喪失和Bcl‐2表達的下降有關［23］。原癌基因Bcl-2與Bax 對細胞凋亡起著重要的調節作用，其中Bcl-2是對細胞凋亡有明顯抑制作用。過度表達的Bcl‐2 不僅能抑制甲狀腺細胞凋亡，同時可減少淋巴細胞對甲狀腺細胞的破壞［24］。Casp9 是細胞凋亡蛋白酶活化因子成員之一，通過與Bcl‐2 家族等蛋白因子的相互作用來調控細胞凋亡的進程［25］。因此，對細胞凋亡過程的調節在夏枯草治療GD 中可能發揮著重要作用。

從PPI 網絡結果可知：AKT1、IL‐6、TNF、VEGFA、TP53、IL‐10、CXCL8 等是夏枯草治療GD的核心靶點。其中，IL‐6、TNF、TP53 等的遺傳變異與GD 發生風險之間存在顯著關聯，也顯示了炎癥相關基因的多態性與GD 的發病機制的密切關系［26，27］。CD40 是一種腫瘤壞死因子受體，是GD 以及多種自身免疫性疾病的免疫調節敏感性基因。甲狀腺CD40 過表達會增加甲狀腺特異性抗體的產生，CD40 通過激活下游細胞因子和趨化因子來介導這種作用，主要包括IL‐6、IL‐8、TNF‐α 等［28］。GD以甲狀腺實質的淋巴細胞浸潤為特征，在甲狀腺組織中，輔助Th1 淋巴細胞可能增強TNF‐α 的產生，CXCL8 分泌隨TNF‐α 濃度的增加而呈劑量依賴性增加。這些因子間會建立一個放大的反饋回路，從而啟動并延續自身免疫過程，CXCL8 可能與疾病的后期慢性持續階段有關［29］。IL‐6 是參與B 細胞活化和調節脂肪細胞代謝的細胞因子，IL‐6 可能通過增加眼眶脂肪/結締組織內自身抗原的表達而在GO的發病中起重要作用［30］。此外，活動性GO 的甲狀腺毒性患者的血清VEGF 升高可能反映了眼眶和甲狀腺組織中長期存在的自身免疫過程以及甲狀腺中血管生成的增強，也反映了眼部炎癥活動的程度［31］。這些核心蛋白廣泛參與了GD 發病中的免疫及炎癥過程，尤其在GO 的發病中顯得更為重要。

從GO 富集分析結果可知，夏枯草主要影響GD的炎癥應答、凋亡過程的負調控等相關生物學過程等。在Graves 病的初期以Th1 細胞介導的炎癥反應為主，而疾病后期主要是Th2 細胞介導的免疫炎癥反應。因此炎癥應答過程的調節在GD 的各個時期都是有效的。正常甲狀腺細胞分裂不活躍，細胞凋亡保持在一個較低水平，這種低水平有利于維持腺體的大小和功能的穩定［32］。而GD 發生時甲狀腺細胞增生活躍并伴有細胞凋亡水平的增加。對于凋亡過程的負調控可能有利于減少毒性淋巴細胞對甲狀腺細胞的破壞作用。KEGG 富集分析結果表明，夏枯草治療GD 的關鍵靶點涉及包括TNF 信號通路、HIF‐1 信號通路、PI3K‐Akt 信號通路及癌癥相關通路。TNF 通路、PI3K‐Akt 通路主要是對炎癥反應及細胞凋亡相關過程的調控。此外，這些通路與GO 關系密切，甲狀腺相關眼病中TSHR 信號直接通過PI3K‐Akt 信號刺激增殖［33］。缺氧也可通過激活眼眶成纖維細胞中的HIF‐1 依賴性途徑來刺激血管生成和脂肪生成，從而影響GO 的組織重塑［34］。GD 與甲狀腺癌發生率之間的關系仍存在較大爭議，癌癥相關通路在疾病中的作用尚需進一步研究。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學對夏枯草治療GD 的主要活性成分、關鍵作用靶點及重要信號通路進行了探討，并通過分子對接對部分成分和靶點進行了驗證。結果表明，夏枯草的多種活性成分可通過炎癥及細胞凋亡等相關過程參與GD 的治療，更值得注意的是這些靶點在GO 中表現得更為重要，也為進一步研究其相關機制奠定了基礎。