反復胚胎移植失敗與首次胚胎移植成功不孕癥患者陰道微生態特點差異

劉艷君 卜曉萌 張巧利 馬延敏

首都醫科大學附屬北京婦產醫院(100026)

體外受精-胚胎移植技術(IVF-ET)及其衍生技術是目前臨床治療女性不孕癥的最有效手段之一，但應用過程中成功率在50%～60%，反復胚胎移植失敗仍是IVF-ET應用中需解決的問題[1]。女性生殖道微生態系統由生殖道微生物菌群、宿主內分泌系統狀態、陰道解剖結構以及局部免疫系統組成[2]。正常情況下陰道以乳桿菌為優勢菌，同時并存多種微生物，與宿主生殖系統相互依賴并相互制約，這種生態平衡對提高女性生殖系統抵御其他病原微生物侵襲具有重要作用[3-4]。生殖系統感染是導致女性不孕重要因素。因此，研究并分析不孕癥女性的生殖道微生態特點對改善患者妊娠結局、提高胚胎移植成功率有至關重要意義。本研究通過分析反復胚胎移植失敗與首次胚胎移植成功的不孕癥患者陰道菌群微生態特點差異，為臨床治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年2月-2019年10月在本院接受胚胎解凍移植(FET)反復失敗(失敗組)和首次胚胎移植成功(成功組)的不孕癥患者臨床資料。納入標準：①反復胚胎移植失敗診斷標準為行≥3次胚胎移植未孕或植入≥10枚優質胚胎仍未受孕；②內分泌檢查無異常；③月經周期正常；④入組前6月無宮腔檢查史，無激素和抗生素等影響檢查結果的藥物服用史；⑤患者及家屬對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：①子宮畸形；②息肉、腫瘤等宮腔異常；③合并宮腔黏連、輸卵管重度積水及子宮內膜結核等病史；④合并甲亢、糖尿病、心臟病等內科疾??；⑤其他已明確導致反復胚胎移植失敗的患者。本研究經本院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1標本采集常規準備消毒后，取清潔干棉簽自患者陰道上1/3至宮頸口處刮取分泌物，涂抹于載玻片上，另取清潔干棉簽再次于相同部位刮取分泌物并放入無菌試管內。

1.2.2標本檢測采用卡尤迪醫學檢驗實驗室陰道炎自動檢測工作站(包括鏡檢系統)、陰道炎聯合檢測試劑盒以及革蘭染色液對標本進行檢測。參考中華醫學會婦產科學分會感染性疾病協作組制定的《陰道微生態評價的臨床應用專家共識》進行陰道菌群微生態特點分析。微生態檢測包括形態學檢測和功能學檢測兩方面：形態學檢測，涂抹分泌物的載玻片經干燥、固定和革蘭染色后置顯微鏡下，觀察菌群多樣性、密集度、優勢菌群、病原微生物、炎性反應等指標。功能學檢測，取1支清潔軟管并滴加5～7滴稀釋液，將帶有分泌物的棉簽插入無菌軟管中順時針旋轉4～5次，使棉簽上的分泌物與稀釋液充分混合為檢測樣本。采用陰道炎自動檢測工作站行功能學檢測，檢測白細胞酯酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、PH值。

1.2.3陰道菌群微生態失調診斷標準正常陰道微生態為菌群多樣性II-III級，菌群密集度II-III級，以乳桿菌為優勢菌，PH值在3.8～4.5，H2O2分泌水平正常，白細胞酯酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸酶等陰性，當菌群多樣性、密集度、優勢菌群、PH值、H2O2分泌水平、機體炎性反應標志物及病原微生物代謝產物等任一指標為陽性，即診斷為微生態失調。微生態失調包括細菌性陰道病(BV)、中間型細菌性陰道病、需氧型陰道炎(AV)、外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)、滴蟲性陰道炎(TV)等。具體診斷標準參考文獻[5]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

共納入符合標準患者157例，其中失敗組77例，年齡(33.3±4.1)歲(28～38歲)，不育(6.1±3.7)年(5～12年)，子宮內膜厚度(0.9±0.2)cm。成功組80例，年齡(32.6±3.5)歲(26～36歲)，不育(6.0±3.1)年(4～10年)，子宮內膜厚度(0.9±0.2)cm。兩組比較無差異差異，移植胚胎均為優質D3胚胎。

2.2 陰道微生態形態學檢測

失敗組陰道分泌物菌群多樣性(I級和IV級)、菌群密集度(I級和IV級)、滴蟲檢測陽性的患者比例均高于成功組(P<0.05)，而真菌檢測占比與成功組無差異(P>0.05)，以乳桿菌為優勢菌的患者占比低于成功組(P<0.05)，兩組患者Nugent評分有差異(P<0.05)。見表1。

表1 兩組陰道微生態形態學各檢測指標比較[例(%)]

2.3 陰道微生態功能學檢測

失敗組陰道宮腔分泌物檢測結果PH>4.6、白細胞酯酶陽性、乙酰氨基葡萄糖苷酶陽性、唾液酸苷酶陽性、β-葡萄糖醛酸酶陽性的患者比例高于，分泌物過氧化氫充足占比低于成功組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組陰道微生態各功能學各檢測指標比較[例(%)]

2.4 陰道微生態失調類型

診斷為微生態失調失敗組有43例(55.8%)患者，成功有11例(13.8%)，兩組相比有差異(P<0.05)。微生態失調類型方面，失敗組中間型BV、BV、AV、TV的檢出率高于對照組(P<0.05)，VVC、BV+VVC、中間型BV+VVC的檢出率兩組相比無差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組陰道微生態失調類型比較[例(%)]

3 討論

輔助生殖技術(ART)發展使不孕患者妊娠率不斷提高，但臨床上仍有部分患者接受多次優質胚胎移植后仍然不能受孕[6]。導致反復胚胎移植失敗[7-8]。探討該類人群反復胚胎移植失敗原因非常重要。女性生殖道微生態體系為動態變化的體系，正常的微生物菌群是維持其穩態的核心內容之一[9]。近年生殖道微生態學也作為一門獨立學科日益受到醫學界關注，通過將微生態學與臨床感染性疾病以及基礎微生物學的研究相結合，評價不孕癥女性陰道菌群微生態環境，從而為臨床診療及預后評估提供科學指導[10-11]。

生殖系統感染是臨床上的常見疾病之一，也是導致女性不孕癥的重要原因之一。此外，女性生殖系統感染還可借助多種機制誘導機體免疫損傷，導致內源性抗子宮內膜抗體和抗精子抗體的產生，降低精子活性及精子與卵細胞的結合幾率，最終導致女性不孕癥的發生[12-13]。本研究通過對比分析反復胚胎移植失敗和首次胚胎移植成功的不孕癥患者的陰道微生態學特點，結果顯示，失敗組陰道分泌物菌群多樣性、菌群密集度、滴蟲檢測、Nugent評分、PH值以及常見病原微生物代謝產物和酶的活性檢測結果與成功組相比均存在差異。正常的微生態特點為以乳桿菌為優勢菌，PH值在3.8～4.6之間，失敗組優勢菌群改變，PH值明顯升高，對病原微生物的清除能力大大降低，可引起多種生殖道炎癥的發生，導致精子與卵細胞結合受阻[14-15]。失敗組微生態失調發生比例高于成功組。微生態失調類型方面，失敗組中間型BV、BV、AV、TV的檢出率及生殖道病原微生物感染率均高于成功組。因此，生殖道微生態失調可能是影響胚胎種植的重要因素之一。

綜上所述，不孕癥患者反復胚胎移植失敗者陰道微生態失調占比更高，提示臨床上應重視對不孕癥患者實施輔助生殖技術前微生態環境的檢測，及時治療，以提高胚胎移植成功率。