不同年齡段不孕女性成熟卵母細胞冷凍復蘇效果的影響因素分析

牛子儒 王 洋 陶立元 鄭曉英 嚴 杰 李 蓉

北京大學第三醫院(100191)

80年代早期國外學者開始應用冷凍解凍后人成熟卵母細胞進行體外受精-胚胎移植(IVF)并使患者成功受孕[1]。隨著輔助生殖技術的廣泛開展及細胞冷凍、低溫保存技術的不斷改進，凍融卵母細胞的復蘇率、受精率和妊娠率都有了顯著提高。美國生殖醫學學會也于2013年提出“人成熟卵母細胞冷凍技術可以廣泛應用于臨床”[2]。但目前卵母細胞冷凍技術在我國尚未廣泛開展，僅限于取卵日男方獲取精子失敗而進行的“應急性卵母細胞冷凍”，對于可能影響卵細胞復蘇的因素尚不十分明確。年齡是影響女性生育力的重要因素[3]，隨著年齡的增加，卵細胞的數量和質量均顯著下降[4]。年齡對人成熟卵母細胞解凍復蘇效果的影響，以及不同年齡段人群冷凍卵母細胞復蘇效果的影響因素是否存在差異等相關研究鮮有報道。本研究回顧性分析因男方原因行應急性卵母細胞冷凍保存的臨床資料，探討不同年齡段女性卵母細胞解凍復蘇的影響因素，為臨床決策提供建議。

1 對象與方法

1.1 對象與分組

回顧性分析2007年8月-2019年12月在本院實施IVF助孕，取卵日因男方獲取精子失敗而接受應急性成熟卵母細胞玻璃化冷凍的不孕癥患者臨床資料。其中男方因素獲取精子失敗包括因突發疾病或意外事故不能到醫院取精、不能進行手淫或手術[經皮附睪精子抽吸術(PESA)和顯微附睪精子抽吸術(MESA)]取精、未能獲得足夠的精子，以及其他意外精子收集失敗。排除女方因惡性腫瘤、卵巢儲備功能下降等因素而行生育力保存的患者。根據卵母細胞解凍后是否存活分為存活組(2003例)和未存活組(688例)，并按年齡分層為<35歲組(2297例)和≥35歲組(394例)。所有患者行成熟卵母細胞玻璃化凍融、胚胎培養和移植前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1促排卵與卵母細胞玻璃化冷凍解凍均按照本院常規操作進行[5]。 復蘇培養后，觀察卵母細胞膜完整、胞質均勻有光澤者視為存活[6]。

1.2.2分析指標包括臨床病史、內分泌和胚胎實驗室相關數據：女方年齡、體質量指數(BMI)、不孕年限、妊娠次數、生產次數、不孕類型(原發/繼發性不孕)、IVF助孕指征(男方因素，女方因素或雙方因素)、基礎性激素水平、竇卵泡數(AFC)、促性腺激素(Gn)應用總劑量及時間，卵母細胞凍存時間和是否存在子宮內膜異位癥(EM)等疾病[7]。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 一般資料

共有251例不孕患者2691枚成熟卵母細胞納入本研究，卵母細胞解凍復蘇存活率為74.4%(2003/2691)，解凍存活組年齡(29.1±4.6歲)小于未存活組的年齡(30.2±5.0歲)(P<0.001)。

2.2 <35歲女性卵母細胞凍融復蘇效果的影響因素分析

解凍存活組的年齡、生產次數，基礎FSH水平和Gn用量均低于未存活組，而AFC高于未存活組(P<0.05)，且解凍存活組EM和卵巢低反應的發生比例低于未存活組(均P<0.05)。見表1。將有統計學差異的變量納入logistic回歸模型，分析顯示，女方年齡大(OR=0.94，95%CI 0.91～0.97)、罹患EM(OR=0.68，95%CI0.49～0.95)為卵母細胞解凍復蘇的獨立危險因素，而AFC多(OR=1.03，95%CI 1.01～1.04)為解凍復蘇的獨立保護因素。

2.3 ≥35歲組卵母細胞凍融復蘇影響因素分析

解凍存活組女方年齡、妊娠次數、基礎雌二醇(E2)和卵子凍存時間均低于未存活組，而不孕年限、生產次數和基礎促黃體生成素(LH)均高于未存活組，且解凍存活組EM和繼發不孕的發生比率低于未存活組(均P<0.05)。見表1。將有統計學差異的變量納入logistic回歸模型，分析顯示，基礎E2水平高(OR=0.98，95%CI 0.98～0.99)、凍存時間長(OR=0.98，95%CI 0.97～0.99)、罹患EM(OR=0.15，95%CI 0.06～0.36)和繼發不孕(OR=0.22，95%CI 0.13～0.37)為解凍復蘇的獨立危險因素。

表1 不同年齡段卵母細胞解凍復蘇影響因素的單因素分析

3 討論

1999年，Kuleshova[8]報道了世界首例卵母細胞冷凍保存后成功妊娠分娩的病例，標志著卵母細胞冷凍保存技術的突破。目前，國內外關于凍融卵母細胞的研究主要集中在IVF結局影響因素的探究。一項納入10個研究2265個卵母細胞凍融周期的meta分析提示，隨著年齡的增長，解凍卵母細胞后的活產率明顯下降[9]。國內一項有關卵母細胞玻璃化冷凍后ICSI妊娠結局的研究也提示女方年齡及成熟卵數對卵母細胞解凍的妊娠結局有重要影響[10]。大多數研究表明，凍融卵母細胞周期與新鮮取卵周期的妊娠結局無明顯差異[11]。但凍融損傷可能會導致卵母細胞的細胞器、紡錘體、染色體和表觀遺傳學出現損傷或變化[12]。本文數據顯示，近1/4的卵母細胞解凍后可能無法存活，女方年齡、卵巢儲備功能、卵子凍存時間和罹患子宮內膜異位癥等因素均會影響成熟卵母細胞玻璃化冷凍后的解凍復蘇效果。

年齡是導致女性生育能力下降的重要因素，卵母細胞的數量和質量均隨著年齡的增長而降低。女性35歲之后卵巢儲備功能和卵母細胞質量明顯下降，流產等不良妊娠結局的發生風險顯著增加[3]。這可能與衰老伴隨的分子生物學改變密不可分。衰老使女性生殖系統中的氧化磷酸化和腺苷三磷酸水平下降，輔酶Q10的利用率下降，進而導致線粒體功能受損[13]，引起卵母細胞質量下降。此外，不同年齡女性的成熟卵母細胞mRNA轉錄組的表達存在顯著差異，這意味著非編碼轉錄組可通過調節某些轉錄后翻譯機制，影響卵母細胞的發育潛能[14]。本研究也提示女性年齡是影響卵母細胞解凍復蘇后是否存活的重要因素，年齡越大，卵母細胞解凍復蘇的成功率越低。

AFC是反應卵巢儲備功能的重要指標之一[15-16]，對IVF結局有良好的預測價值。但受限于超聲儀器的分辨率、監測標準和時間的不統一以及無法辨識出閉鎖卵泡等因素[16]，AFC可能高估了對促排卵有反應的真實卵泡數。本研究提示AFC是影響年齡<35歲的患者卵母細胞解凍復蘇效果的關鍵因素，這可能是由于AFC更能反應年輕患者的卵巢儲備情況，間接體現了卵母細胞的質量。而對于高齡女性，AFC普遍偏少，其反應卵母細胞質量的可行性隨之降低。

本研究提示，EM是唯一一個對兩個年齡段女性卵母細胞復蘇效果均有負面影響的關鍵因素。大量的研究已經證實，EM是導致女性不孕的重要因素之一，它通過抑制細胞內P450芳香化酶的表達、增加活性氧生成等作用改變卵泡內環境和顆粒細胞特征，通過減少皮質顆粒和導致透明帶硬化，干擾受精、影響胚胎孵化和著床[17]。此外，EM還會造成卵細胞成熟障礙[18]、卵細胞質量下降和基因缺陷發生率明顯增加[19]?；加蠩M者卵細胞凍融復蘇效果明顯下降可能與上述原因密切相關。后期可以對EM患者的卵母細胞進行更全面的基礎分析，了解玻璃化冷凍過程對其的影響。

E2在調節卵母細胞成熟和胚胎著床等方面都起著關鍵作用，基礎E2水平是評價卵巢儲備功能的重要指標，在卵巢儲備功能減退的患者中往往會先于卵泡刺激素(FSH)提前升高。隨著卵巢儲備功能的下降，卵泡期和黃體期的抑制素水平也明顯下降，削弱了對FSH的抑制作用，使得FSH峰提前出現，導致卵泡提前募集，甚至在月經期出現直徑10mm以上的卵泡，升高的E2進一步抑制FSH的分泌和釋放,出現月經期基礎FSH水平正常但E2水平升高的現象?；AE2升高(≥275.3pmol/L)往往預示著卵巢反應不良、高周期取消率和低胚胎種植率[20]。本研究表明，≥35歲組，隨著基礎E2水平的上升，卵母細胞解凍復蘇的成功率明顯下降。對于這部分人群，可以通過基礎E2的水平預測卵母細胞解凍后復蘇成功率。

凍存時間是否影響成熟卵母細胞的解凍復蘇效果，不同的研究結果不一。Yan等[21]的研究提示，凍存時間越長，卵母細胞的解凍復蘇率越低。而Stigliani等[22]的研究則表明冷凍本身會對卵母細胞造成損傷，但凍存時間的長短并不改變卵細胞的基因譜。本研究結果也提示，對年齡<35歲女性，凍存時間不影響卵母細胞的解凍復蘇；而對于年齡≥35歲女性，隨著凍存時間的延長，卵細胞的解凍存活率明顯下降，這可能與高齡女性卵母細胞質量下降、冷凍和解凍過程進一步加速了卵母細胞的凋亡有關，但仍需要進一步的基礎實驗證實，以了解其分子水平的變化和機制。

綜上所述，年齡是影響人成熟卵母細胞解凍復蘇的關鍵因素，不同年齡段的女性，影響卵細胞凍融復蘇的因素略有不同。35歲之前，隨著年齡的增長、AFC的減少和EM的發生，卵母細胞解凍失敗的風險明顯增加。35歲之后，基礎E2水平升高、凍存時間延長和EM等因素均是卵母細胞解凍失敗的關鍵危險因素。