血清miR-27、PPAR-γ表達與妊娠期糖尿病胰島素抵抗

王麗娜 劉春梅 胡葉青 莊守存

1.河北省唐山市豐南區胥各莊鎮中心衛生院(063300)； 2.河北省唐山市人民醫院；3.河北省唐山市豐南區婦幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)發病因素尚未完全明確，但研究認為其與遺傳、炎癥反應、胰島素抵抗(IR)、微小RNA(miRNA)、糖脂代謝異常等相關[1-2]。研究發現，miR-27a作為miR-27基因家族重要成員，其在IR細胞中呈高表達，且具有診治糖尿病IR的潛在價值[3]；另外，過氧化物酶增殖體激活受體-γ(PPAR-γ)在GDM女性中水平異常，其可能在GDM病理發展過程中起重要作用[4]。此外，因IR是GDM發病重要因素，故臨床常以穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)判斷GDM IR水平，且HOMA-IR在GDM孕婦中水平上調，有助于評估GDM[5]。推測miR-27表達異常與GDM病理變化有關?；诖?，本研究擬通過初步檢測GDM孕婦血清miR-27、PPAR-γ水平，分析兩者相關性，以期為臨床診治GDM提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院與唐山市豐南區婦幼保健院合并以來2017年5月-2020年7月診治的GDM孕婦(GDM組)，按有關診療指南標準診斷[6]。納入標準：單胎妊娠，符合GDM相關診斷標準；檢查資料完整，自愿配合完成研究。排除標準：①合并甲狀腺疾病、肝腎功能不全、垂體腎上腺、高血壓；②孕前患有糖尿??；③合并惡性腫瘤、多囊卵巢綜合征；④有吸煙、飲酒不良嗜好；⑤有分娩多胎、畸形胎兒、宮內生長受限胎兒、死胎史；⑥輔助生殖技術受孕。同期產前檢查健康孕婦(對照組)。孕婦及家屬簽署知情同意書，研究符合經本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1樣本采集收集孕婦空腹外周靜脈血置無菌真空管中，均分成兩份。一份于室溫下靜置30min，離心分離血清，檢測血清miR-27、PPAR-γ水平；另一份置含肝素抗凝管中離心分離血漿，檢測空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FBG)水平。檢測送本市三甲醫院完成。

1.2.2血清miR-27檢測實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法。取適量凍存血清冰上解凍，加適量cel-miR-39(校正血清miR-27水平)，按miRNA純化試劑盒(上海富衡生物科技有限公司)說明純化miRNA。根據microScript microRNA cDNA Synthesis Kit(艾美捷科技有限公司)說明書獲取cDNA。參照miRNA qRT-PCR Kit(北京博邁斯科技發展有限公司)說明書配反應體系，利用qRT-PCR儀(上海力新儀器有限公司)擴增。引物均由上海生工生物工程公司合成，以2-△CT法分析血清miR-27相對表達量，其中△CT=目的基因CT值-cel-miR-39 CT值。

1.2.3血清PPAR-γ檢測酶聯免疫吸附法(ELISA)。取出人PPAR-γ ELISA試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)，依照其說明書將標準品配制成一系列濃度的標準品溶液，檢測標準品溶液的吸光度，繪制PPAR-γ標準回歸曲線；解凍適量血清，室溫下平衡20 min，于酶標板中加血清，37℃培養箱中孵育30min，加生物素工作液(含PPAR-γ抗體)，37℃孵育50min 后棄反應液，磷酸緩沖液洗3次后 加顯色液，37℃孵育30min 加終止液，利用酶標儀(上海格索普生物科技有限公司)測定樣本450nm處吸光度值，計算血清PPAR-γ濃度。

1.2.4檢測IR相關指標解凍適量血漿，利用人胰島素試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)按化學發光法檢測FINS水平；利用葡萄糖測定試劑盒(上海榕柏生物技術有限公司)及全自動生化分析儀(北京益仁恒業科技有限公司)檢測FBG水平。利用HOMA-IR評價IR水平，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般臨床資料

GDM組131例，年齡(29.9±6.1)歲(23～38歲)，孕周(33.9±3.6)周(28～38周)；產次(1.8±0.8)次(1～3次)；孕前體質量(54.8±6.5)kg(48～65 kg)。對照組135例，年齡(30.1±6.2)歲(23～38歲)；孕周(34.1±3.6)周(28～38周)；產次(1.7±0.7)次(1～3次)；孕前體質量(55.0±6.6)kg(47～66 kg)。兩組上述指標無差異(P>0.05)。

2.2 血清miR-27、PPAR-γ水平

與對照組相比，GDM組血清miR-27水平升高，PPAR-γ水平降低， FINS、FBG、HOMA-IR水平GDM組均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清各檢測指標水平比較

2.3 GDM孕婦血清各指標相關性

Pearson法分析顯示，GDM孕婦血清miR-27水平與HOMA-IR呈正相關(P<0.05)，血清PPAR-γ水平與HOMA-IR呈負相關(P<0.05)。見表2。GDM孕婦血清miR-27水平與PPAR-γ呈負相關(r=-0.457，P<0.05)。見圖1。

表2 GDM孕婦血清miR-27、PPAR-γ水平與FINS、FBG、HOMA-IR的相關性

圖1 GDM孕婦血清miR-27水平與PPAR-γ的相關性

3 討論

GDM可導致產婦發生感染、流產，升高畸形胎兒、極低體重兒、新生兒低血糖發生率，對母嬰健康構成極大威脅[7]。且GDM診療有一定局限性，尋找與GDM發病相關因素及時干預，對改善孕婦及胎兒結局有積極意義。

miRNA是穩定存在于血清、血漿的RNA小分子，其可調控自噬、信號轉導、氧化應激、細胞發育、炎癥反應等生理病理過程，與糖尿病腎病、糖尿病、肥胖、GDM發病進程關系密切[8-9]。研究發現，miR-27可通過與靶基因PPAR-γ結合影響脂肪細胞分化、增殖、脂肪代謝、胰島素信號傳導及炎癥反應[10]。體外研究顯示，miR-27a可通過調節胰島素信號通路及靶向作用PPAR-γ，進而影響脂肪細胞IR[11]；另外在2型糖尿病患者血清中表達上調[12]。以上研究表明，miR-27表達失調可能與IR類疾病顯著相關。本研究中GDM組孕婦血清miR-27表達水平高于對照組，推測高水平miR-27可能通過靶向相關基因，影響有關信號傳導途徑促進炎癥反應，進而調節血糖代謝，促進IR[3]，從而影響GDM疾病進展。具體機制仍有待研究證實。

PPAR-γ可影響胎盤發育、胎盤滋養層細胞分化、能量代謝，調節血壓，抑制炎癥反應，與糖尿病、糖尿病腎病、GDM病變過程密切相關[13-14]。研究發現，PPAR-γ在GDM孕婦胎盤中水平異常，可能通過影響炎癥反應在GDM疾病進展中發揮作用[15]；另外，動物實驗研究顯示，PPAR-γ在妊娠糖尿病大鼠中表達下調，經肉桂醛給藥后表達上調，PPAR-γ可能參與并影響妊娠糖尿病[16]。以上研究表明，PPAR-γ異常表達可能與GDM有關。本研究中GDM組孕婦血清PPAR-γ水平低于對照組，提示PPAR-γ可能在GDM病理過程中起作用，究其原因，低水平PPAR-γ抑制炎癥能力降低，使糖脂代謝紊亂，影響胎盤代謝及IR，從而影響GDM發生發展過程，但作用機制仍需深入探究證實。

IR是一種由各種因素引發胰島素作用的細胞、組織器官利用葡萄糖能力降低的病理狀態，可由生理性發展成GDM[17]。研究發現，FINS、FBG、HOMA-IR在GDM孕婦中水平均上升，且HOMA-IR是GDM發生的危險因素，患者對胰島素敏感性降低[18]。本研究中GDM組孕婦FINS、FBG、HOMA-IR水平均高于對照組，與譚晶等[18]研究結果相符，提示IR與GDM發病進展相關。

朱磊等[19]研究顯示，低氧訓練可通過miR-27影響靶基因PPAR-γ表達進而改善血脂水平，影響體脂含量。本研究探討GDM孕婦血清指標相關性顯示，血清miR-27水平與PPAR-γ呈負相關，提示miR-27可能與PPAR-γ相互影響共同影響GDM病情進展，但具體影響機制有待深入研究證實。本研究GDM孕婦血清miR-27水平與HOMA-IR呈正相關，PPAR-γ水平與HOMA-IR呈負相關，提示miR-27、HOMA-IR可能與IR相互作用共同在GDM進展中發揮作用。

綜上所述，GDM孕婦血清miR-27水平上調，PPAR-γ水平降低，兩者呈負相關，其可能與IR相互影響，進而共同影響GDM疾病過程，miR-27、PPAR-γ可能是診治GDM的潛在靶標。但本研究未對miR-27、PPAR-γ在GDM中機制進行深入探究，后續將加大樣本量進一步探討。