高糖條件下Exendin-4對骨髓間充質干細胞增殖分化的影響

石曉娜 周麟 張悅 陳莉媛 羅靜雯 鄭新城 林東

糖尿病是口腔種植修復的高風險因素。由于高血糖損害成骨細胞功能，減少骨轉化，影響種植體周圍骨結合[1-3], 因此糖尿病是牙種植修復的一個難題。

腸促胰素類藥物是2型糖尿病的一種常用治療藥物，主要包括胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑。有研究發現腸促胰素類藥物不僅有控制血糖的作用，還能通過促進骨形成，抑制骨吸收兩方面影響糖尿病患者的骨代謝[4-6]。有研究表明GLP-1能通過增強Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞的增殖分化，亦能與脂肪間充質干細胞上的GLP-1受體結合誘導脂肪間充質干細胞向成骨細胞分化，從而促進骨形成[7]。

艾塞那肽(Exenatide)主要成分為Exendin-4。Exendin-4是一種從北美希拉巨蜥唾液中發現的長效GLP-1受體激動劑。它和GLP-1具有相似的生理功能，能調節血糖,保護胰島β細胞[8]。本實驗以大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)為研究對象,觀察Exendin-4對高糖條件下BMSCs增殖分化的影響，以進一步探討Exendin-4對2型糖尿病骨代謝及種植體周圍骨結合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(200±20) g 雄性SD大鼠(福建醫科大學動物實驗中心)；Exendin-4(Sigma公司， 美國)；高糖DMEM培養基、低糖DMEM培養基(Hyclone公司， 美國)；ALP活性檢測試劑盒、CCK-8溶液、Western及IP細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Gibco公司， 美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離培養 180～220 g健康雄性 SD大鼠，脫頸處死，無菌條件下剝離股骨，收集骨髓細胞于10%FBS， 1%青鏈霉素雙抗的低糖DMEM培養基中并接種于培養皿，放置在37 ℃ 5%CO2培養箱中培養， 3 d后換液，培養7 d后，細胞貼壁生長，呈較均勻梭形，長滿90%左右，進行傳代培養。選取生長良好的P4～P6細胞制成細胞懸液后分組培養，進行后續實驗。實驗分組：以BMSCs為實驗對象，分為對照組(對照組，低糖DMEM培養基含糖5.6 mmol/L)；高糖組(HT組，高糖DMEM培養基 含糖25 mmol/L)；高糖聯合不同濃度Exendin-4干預組(HG+E1組 Exendin-4 1 nmol/L，HG+E5組Exendin-4 5 nmol/L， HG+E10組Exendin-4 10 nmol/L，HG+E15組Exendin-4 15 nmol/L)。

1.2.2 大鼠BMSCs的增殖實驗 BMSCs分組接種于24 孔板， 2×104/孔，每組設3 個平行孔。培養1、 3、 7 d后，棄去舊培養基，每孔中加入500 μL的新鮮培養基， 50 μL的CCK-8溶液。置于37 ℃細胞培養箱中，繼續培養2 h。每孔吸取200 μL反應液至96 孔板中。在450 nm利用酶標儀檢測其吸光度值,觀察細胞的增殖情況。

1.2.3 細胞內堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 BMSCs分組接種于24 孔板， 2×104/孔， 每組設3 個平行孔。培養7 d后，棄細胞上清液，PBS沖洗3次，加入100 μL裂解液1%的Triton X-100，進行4個凍融循環裂解細胞。ALP活性檢測試劑盒測定裂解液中ALP活性，在405 nm測其吸光度值。

1.2.4 細胞外基質礦化檢測 BMSCs分組接種于24 孔板，2×104/孔，每組設3 個平行孔。培養14 d后，棄細胞上清液，PBS沖洗3 次后，75%的酒精固定1 h， 40 mmol/L的茜素紅(pH=4.2)細胞外基質染色10 min。去離子水漂洗試樣5次直至不再脫色，體式顯微鏡照相。10%氯化十六烷基吡啶(溶劑為PBS緩沖液)溶解試樣表面染料，在630 nm測其吸光度進行定量分析。

1.3 統計方法

應用 GraphPad Prism7和SPSS 16.0 軟件進行統計分析。2 組之間定量數值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，檢驗水準 α=0.05，P<0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs細胞培養

分離得到的骨髓細胞呈圓形, 大小不一，含少許雜細胞， 72 h后換液可見細胞貼壁生長， 5～6 d后細胞增殖迅速， 10～12 d時細胞達90%融合,細胞呈梭形。傳代培養后，細胞狀態漸趨穩定，取生長狀態較好的P4代細胞進行實驗(圖 1)。

圖 1 BMSCs倒置顯微鏡下形態

2.2 Exendin-4 對BMSCs增殖的影響

培養1、 7 d時，與對照組相比,HT組BMSCs的增殖能力均受到明顯抑制(P<0.05)。與HT組相比，Exendin-4在短時間干預(1～3 d)時，未見其對高糖條件下BMSCs增殖的影響，而長時間干預(7 d)時，低濃度(1 nmol/L)Exendin-4可略增加高糖培養的BMSCs增殖，但無統計學意義，而高濃度(15 nmol/L)Exendin-4 在3、 7 d時均對BMSCs增殖有顯著抑制作用(P<0.05)(圖 2)。

圖 2 Exendin-4對高糖誘導的BMSCs增殖的影響

2.3 Exendin-4 對BMSCs ALP活性的影響

ALP活性檢測結果(圖 3)顯示：與對照組相比，HT組BMSCs 的ALP活性無明顯改變(P>0.05);與HT組相比，HG+E1組BMSCs ALP活性顯著增高(P<0.01)，HG+E5、HG+E10、HG+E15組BMSCs ALP活性與HT組相比有增高，但未見統計學意義。

圖 3 Exendin-4對BMSCs ALP活性的影響

2.4 Exendin-4 對BMSCs向成骨細胞分化時鈣沉積量的影響

培養14 d后，對細胞進行茜素紅染色(圖 4)后觀察見：對照組礦化結節出現較少，HT、HG+E1、HG+E5、HG+E10、HG+E15組均出現成骨細胞礦化結節；半定量檢測(圖 5)結果顯示：15 nmol/L的Exendin-4可顯著抑制高糖培養下BMSCs的鈣沉積量(P<0.01)。

圖 4 BMSCs 不同濃度Exendin-4干預14 d茜素紅染色(×40)

圖 5 BMSCs茜素紅染色半定量分析

3 討 論

隨著人們生活條件不斷提高，糖尿病的患病率也迅速提高。據2010流行病學調查，我國成年人糖尿病患病率為11.6%，糖尿病前期患病率為50.1%[9]。糖尿病是影響牙種植修復的一個高風險因素，其高糖環境不利于骨髓間充質干細胞發揮功能，減少成骨轉化，影響種植體周圍骨結合。GLP-1類藥物是一類在臨床上廣泛應用的降糖藥物。有研究發現GLP-1激動劑可促進骨形成，抑制骨吸收，增強骨材料性能[10]。 Pereira等[11]發現Exendin-4可以改善糖尿病大鼠骨增量。

種植體周圍骨結合的關鍵是骨髓間充質干細胞的成骨分化。成骨細胞的分化過程包括增殖、細胞外基質礦化、成熟等[12]。堿性磷酸酶來源于成骨細胞的分泌，其活性代表了成骨細胞的礦化能力，是成骨細胞分化成熟的早期標準之一[13]。成骨細胞可形成礦化結節，礦化結節若經茜素紅染色呈紅色,說明體外培養的BMSCs有分化為成骨細胞的趨勢[14]。因此為探討高糖條件下 Exendin-4 能否促進 BMSCS的增殖、成骨分化，增加骨形成，本研究對BMSCs細胞進行了CCK-8增殖實驗以及對細胞堿性磷酸酶和礦化結節兩種成骨標志物進行了檢測。

有多位學者研究發現Exendin-4可促進BMSCs增殖分化，且其促進作用隨Exendin-4濃度增加而增強[15-17]。而本實驗通過檢測細胞增殖發現：細胞培養1、 3 d時，高糖條件下，Exendin-4對BMSCs的增殖能力無明顯促進作用。此結果與Paola等學者研究發現的Exendin-4短期干預(24、 48、 72 h)不影響MSC的增殖相似[18]。 7 d時，低濃度(1 nmol/L)Exendin-4可略增高高糖下BMSCs的增殖能力，但未見統計學意義，可能需要進一步延長干預時間，而高濃度Exendin-4 (15 nmol/L)對高糖條件下BMSCs的增殖能力有明顯的抑制作用。ALP檢測結果示高糖條件下， Exendin-4 1～15 nmol/L干預下BMSCs均有向成骨細胞分化的趨勢，具有成骨活性，其中，Exendin-4 1 nmol/L時其對BMSCs的成骨分化效應最佳；茜素紅染色半定量分析示14 d時，各組細胞基質均出現礦化結節，Exendin-4 15 nmol/L對BMSCs成骨分化成熟有抑制作用。

綜上研究發現，經過較長時間的高糖培養和Exendin-4干預，高濃度(15 nmol/L)Exendin-4可抑制細胞增殖與分化成熟,而低濃度的Exendin-4對BMSCs的增殖能力雖無明顯促進作用但可促其成骨細胞標志物ALP分泌增加。此結果說明在較長時間低濃度Exendin-4干預下BMSCs ALP濃度的升高并非由細胞數量增多所致，而可能通過低濃度Exendin-4促進細胞成骨相關通路而使分泌增加。有研究發現Exendin-4能通過Wnt/β-catenin、Hedgehog/Gli1、PKA-STAT3通路、RANKL/RANK/OPG 系統等途徑促進BMSCs增殖分化[19-20]。因此要明確低濃度Exendin-4促進細胞ALP分泌增加的途徑，還需后續實驗探索其機制。此外，除ALP外，OCN也是骨細胞成熟的重要評價指標之一，而RUNX是成骨分化過程中的必要因子，它能調控OCN轉錄因子的表達，增加RUNX2基因的表達，就能夠增強BMSCs向成骨細胞的誘導[21-23]。所以為進一步完善實驗，本課題還需通過定量檢測OCN、RUNX2基因對應的mRNA進行研究。