組織蛋白酶B介導人參多糖聯合順鉑對肝癌細胞增殖抑制作用的研究

郭林娜，姚立杰，王璐璐，李國鋒，姜楊，金海峰，何軍

齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

人參對中樞神經系統、人體免疫系統、消化系統、心血管系統等有一定的功效[1]。人參的活性成份為多糖和皂苷，有研究表明人參多糖具有抗腫瘤、免疫調節、抗疲勞、降血糖、抗輻射等作用[2-3]。人參多糖的抗腫瘤作用的研究，近幾年也備受學者關注，如對舌癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤細胞的增值具有抑制作用[4-8]。文獻表明：順鉑能與線粒體、溶酶體等多種細胞器作用而產生細胞毒性[9]，參與增殖、遷移等多種生物學功能[10]，對腫瘤細胞起到殺傷作用。其中溶酶體是自噬溶酶體的組成部分[11]，組織蛋白酶B（cathepsin B）作為組織蛋白酶家族成員之一，是溶酶體酶復合物的組成部分，參與溶酶體介導的自噬細胞死亡過程。因此，cathepsin B的表達多少可間接反映細胞自噬的情況。為了探索人參多糖增強順鉑對人肝癌HpeG2細胞殺傷作用的機制是否與組織蛋白酶B的表達水平有關系，該研究于2018年3月—2019年3月間利用CCK8細胞增殖檢測實驗和Western blot蛋白印跡實驗，對人參多糖增強順鉑對人肝癌HpeG2細胞殺傷作用及機制進行初步研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

培養細胞用超凈工作臺SW-CJ-1FDA，371氣套式二氧化碳細胞培養箱，觀察細胞倒置顯微鏡IMT-2，Multiskan Ascent型多功能酶標儀。人肝癌HpeG2細胞由哈爾濱醫科大學第一附屬醫院實驗室提供。CCK8同仁化學研究所（批號JQ701）；順鉑注射液（國藥準字H53021740，2 mL:10 mg）；一抗、二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司提供（批號20150610），其他分析純為國產或進口。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養取人肝癌HepG2細胞復蘇，培養基為DMEM，并添加10%小牛血清及雙抗（100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素），取4 mL配制好的培養基，加入常規培養瓶中，放置于37℃，5%CO2的培養箱內培養，1 d換液1次。3 d左右傳代1次。取對數生長期的細胞進行其他實驗。

1.2.2 實驗分組實驗設順鉑組、GPS組、GPS+順鉑組、E-64+GPS+順鉑組、E-64+順鉑組。用培養基將GPS注射液稀釋為80 mg/L濃度組，空白對照組加培養基，用培養基將順鉑注射液稀釋為2.5、5、10、15、20μg/mL。實驗培養時間為24 h。

1.2.3 細胞增殖檢測（CCK8比色實驗）取對數生長期的人肝癌HpeG2細胞，0.25%胰酶消化、吹打、離心，血球儀計數，用培養液稀釋制備成1×104/mL的人肝癌HpeG2細胞懸液，取96孔板，設1列為空白對照組，1列為GPS組，1列為GPS+順鉑組，1列為E-64+GPS+順鉑組，每列設4個復孔?？瞻讓φ战M每孔接種100μl人肝癌HpeG2細胞懸液，加入80 mg/L的人參多糖20μl，順鉑組分別加濃度為2.5、5、10、15、20μg/mL的試劑200μl（確定IC50為：15 mg/L，以此濃度完成實驗），E-64μM,37℃，5%CO2的培養箱內培養24 h取出培養板，吸出孔內多余培養液，向各孔內加120μl培養液和15μl CCK8，再放入培養箱培養1 h后取出，置全自動酶標儀上，調整波長為490 nm，測吸光度A值，各組A值除以空白對照值組A值，計算空白順鉑組、GPS組，GPS+順鉑等組細胞抑制率。細胞抑制率=[1-（GPS組A值/對照組A值）]×100%。

1.2.4 Western blot檢測法第一步細胞裂解：取GPS+順鉑組、E-64+GPS+順鉑組的人肝癌HpeG2細胞，用0.25%的胰酶消化細胞，收集至EP管內，向EP管內加100μl細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃14 000 g離心10 min，取上清加入EP管做好標記。第二步蛋白定量：將蛋白標準品稀釋及人肝癌HpeG2細胞樣品蛋白分別加入96孔板上，每組設4個復孔，每孔加BCA200μl，37℃孵育30 min，置自動酶標儀中檢測570 nm波長的A值，根據A值與濃度之間的關系，繪制標準曲線，計算樣品的蛋白濃度，用細胞裂解液將樣品蛋白濃度調整為2μg/μl，100℃加熱5 min，冷卻后-20℃冰箱保存。最后Western blot檢測法檢測：根據抗體要求配置濃縮膠和分離膠，按18μl每孔蛋白樣品上樣，先在電壓100 V，電泳時間30 min后，改為110 V，電泳時間為2 h，轉膜電壓70 V，時間根據蛋白分子量大小而定，5%的脫脂奶粉封膜1 h，麗春紅染色3 min，用TBST洗膜3次，5 min/次，按1∶500加一抗，4℃冰箱過夜，第2 d，TBST洗膜2次，5 min，按1∶5 000滴加二抗，室溫下孵育2 h，ECL發光、顯影、定影，以β-actin為內參蛋白，計算出每種檢測蛋白的相對表達量。

1.3 統計方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料的表達方式為（±s），組間比較采用單因素方差分析，應用Dunnet-t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參多糖聯合順鉑增強順鉑對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用

CCK8結果表明：人參多糖與人肝癌HepG2細胞作用24 h后，對其增殖抑制率為（12.69±1.64）%，人參多糖聯合順鉑與人肝癌HepG2細胞作用24 h后，對其增值抑制率為（54.27±2.11）%，順鉑單獨與人肝癌HepG2細胞作用24 h后，對其增值抑制率為（48.28±1.26）%，GPS+順鉑組對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制率顯著高于順鉑組，差異有統計學意義（t=4.219，P＜0.05）。見圖1。

圖1 GPS和順鉑對于人肝癌HepG2細胞增值抑制率（n=3）Figure 1 Inhibitory effects of GPS and CISPLATIN on proliferation of human hepatocellular Carcinoma HepG2 cells（n=3）

2.2 組織蛋白酶抑制劑E-64減輕GPS聯合順鉑對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用

順鉑組、E-64+順鉑組、GPS+順鉑組及E-64+GPS+順鉑組與人肝癌HepG2細胞作用24 h后用CCK8法檢測增 值 抑 制 率 分 別 為 （49.28±1.83）%、（50.61±1.18）%、（53.88±1.36）%、（47.37±0.98）%,表明組織蛋白酶抑制劑E-64在一定程度上抑制了GPS+順鉑組對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用，E-64+GPS+順鉑組與GPS+順鉑組比較差異有統計學意義（t=6.727，P＜0.05），而順鉑組與E-64+順鉑組比較差異無統計學意義（t=1.781，P=0.105）。見圖2。

圖2 E-64、人參多糖和順鉑對于人肝癌HepG2細胞增值抑制率（n=3）Figure 2 Inhibitory effects of E-64,Ginseng polysaccharide and Cisplatin on proliferation of Human Hepatoma HepG2 cells（n=3）

2.3 GPS聯合順鉑對人肝癌HepG2細胞的cathepsin B表達的影響

Western blot檢測結果：GPS聯合順鉑處理24 h后對人肝癌HepG2細胞中的cathepsin B組織蛋白酶活性表達逐漸上調（1.78±0.23），與順鉑單獨作用組（1.27±0.17）相比，人參多糖聯合順鉑組可以上調cathepsin B表達，差異有統計學意義（t=3.089，P＜0.05）。見圖3。

圖3 GPS和順鉑對于人肝癌HepG2細胞的cathepsin B表達的影響（n=3）Figure 3 Effects of GPSand cisplatin on the expression of Cathepsin B in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells（n=3）

3 討論

原發性肝細胞癌（HCC）是全世界人民面臨的主要健康問題，是目前全球范圍內發病率和致死率最高的惡性腫瘤之一，且男性發病率相比女性發病率更高，惡性腫瘤致死率排名第2位[12-13]。目前的治療手段以手術切除為根治性的治療手段,術后5年生存率為50%～70%[14]，然而肝癌的發病隱匿、發展比較快，絕大部分肝癌患者確診時已經是中晚期，失去根治性手術治療的最佳時期。雖然，肝癌的手術適應證不斷放寬，但是，仍有部分中晚期患者無法進行根治性手術[15]。中晚期肝癌患者則主要以局部消融、介入治療，全身化療、局部放射治療等為主?？墒?，肝癌對化療藥物的敏感性不高，制約了化療在肝癌治療中的應用。這一點在肝癌的治療指南中可以有所了解：多種指南均未把全身化療作為一線治療方案推薦[16]。有專家認為，肝癌對化療敏感性降低，可能是由于患者本身的基礎病肝硬化，使肝臟本身的血流動力學發生改變，導致作用肝癌細胞的化療藥物濃度較少?？傊?，對肝癌的化療抵抗機制了解不足。但對于肝癌晚期患者而言，無論是靜脈化療還是動脈化療，對于延長患者的生命就變得尤為重要。那么，如何增強肝癌對化療的敏感性也就成為提高患者生存期的重點。目前，化療藥物聯合中藥制劑在腫瘤化療中廣泛使用，因為，中藥制劑可增加化療藥物的作用，而且減少化療藥的不良反應及耐藥性[17]。中藥制劑多數為天然植物藥物的提取物，具有安全性高且低毒性的特性，期待能提高化療藥物的敏感性。

該實驗CCK8結果表明GPS聯合順鉑對人肝癌HepG2細胞增殖抑制作用明顯高于順鉑組，增值抑制率為（54.27±2.11）%。此結果與李安等[18]報道的人參多糖聯合奧沙利鉑對肝癌細胞的增值抑制作用明顯增加的結果相似，同等濃度下抑制率為58%左右。提示人參多糖可能提高鉑類化療藥物對肝癌的敏感性。既往研究表明[19]，cathepsin B作為溶酶體中重要的蛋白水解酶，存在于多種細胞的溶酶體和巨噬細胞中，在細胞凋亡過程中發揮重要作用,同時溶酶體對細胞自噬作用正常進行也非常重要,cathepsin B參與細胞凋亡是因為cathepsin B可將Bcl-2家族中Bid蛋白切割成tBid蛋白,tBid蛋白具有更強大的促進細胞凋亡的能力。而cathepsin B參與細胞自噬作用則是因為自噬體需與溶酶體形成自噬溶酶體，才能啟動自噬過程。所以，自噬體和溶酶體的動態平衡保證了細胞自噬的正常進行。又有文獻報道E-64能夠抑制溶酶體內部釋放的包括cathepsin B在內的等多種組織蛋白酶活性。因此，為了進一步驗證GPS在GPS+順鉑對人肝癌HepG2細胞殺傷作用增強的機制，該實驗在GPS+順鉑組加入了組織蛋白酶抑制劑E-64。實驗結果證明：GPS+順鉑組加入組織蛋白酶抑制劑E-64，下調了GPS聯合順鉑對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用。說明組織蛋白酶可能介導人參多糖聯合順鉑對肝癌細胞增殖抑制作用。為證實組織蛋白酶的表達是否與人參多糖增敏順鉑對肝癌的殺傷作用有關，該實驗進一步檢測了GPS+順鉑組及順鉑組人肝癌HepG2細胞內cathepsin B的表達情況，結果表明：GPS+順鉑組的cathepsin B表達與順鉑組相比較有所上升（1.78±0.23），而GPS+順鉑組細胞增殖抑制率也有所提高。這與涂龍霞等[20]報道的TRAIL提高人胃腺癌SGC-7901細胞凋亡率，可能是通過提高cathepsin B蛋白表達率（1.25±0.08），促進細胞凋亡的結論一致。因此，提示人參多糖可以增強順鉑對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用，其機制可能是人參多糖上調了細胞內組織蛋白酶cathepsin B表達而實現的。人參多糖+順鉑組的cathepsin B表達較順鉑組提高，可能使cathepsin B介導的自噬及凋亡作用增強，進而增強了順鉑對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用。而該實驗中加入組織蛋白酶抑制E-64后人參多糖+順鉑組對人肝癌HepG2細胞增殖的抑制減少，因此，可推測組織蛋白酶抑制E-6[4]抑制了cathepsin B的表達，導致人參多糖聯合順鉑組對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用減弱。進一步證明cathepsin B的表達上調可能與人參多糖增強順鉑對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用有關[21]。

綜上所述，人參多糖對順鉑的抗腫瘤活性起到協同作用，同時，由于人參多糖對氧化應激損傷的正常肝細胞具有保護作用，可以減輕化療藥物順鉑對正常肝細胞的毒副作用。為人參多糖聯合順鉑在臨床上治療原發性肝癌中晚期患者提供理論支持。但更深入的機制需要進一步研究、探討。