大蒜油的抗凝血作用

周麗麗，朱艷雯，姜曉霞，張 旋，檀德宏，劉 玲，白 冰*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

血栓性疾病包括動脈粥樣硬化、動脈血栓形成和深靜脈血栓形成[1]，越來越多的患者受此類疾病的困擾。止血作為有效的生理防御機制能夠保證血液在循環中正常流動，而止血障礙會加速血栓的形成[2]。除了血小板和凝血因子，凝血酶的激活和抑制在止血中也發揮了關鍵性作用[3]。凝血酶是一種損傷處血管內皮細胞產生的多功能蛋白酶，它參與凝血過程中各個關鍵性環節，主要將纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，并與后者交聯形成血栓[4-5]。目前，抗凝血研究通常圍繞內源性抗凝血途徑（活化時間凝血酶時間（activation time thrombin time，APTT））、外源性抗凝血途徑（凝血酶原時間（prothrombin time，PT））、共同抗凝血途徑（凝血酶時間（thrombin time，TT））以及降低纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）開展?？诜种颇傅目鼓幬铮ㄈ缛A法林）是預防和治療血栓的常用方法。但目前常用的抗凝血藥物可能會帶來出血等健康風險[6-7]。因此，尋找安全有效的抗凝血成分一直是人們關注的焦點。最新的研究表明大蒜苗能夠通過改變APTT、PT、TT、FIB含量而發揮抗凝血作用[8-9]，揭示了蔥屬抗凝血活性的潛能[10]。

大蒜油是一種辛辣味的揮發油，具有多種生理活性，還有抗腫瘤[11]、抗癌[12]、抗動脈粥樣硬化[13]、抗血栓[14]、抗糖尿病[15]、抗血小板聚集[16-17]、抗炎[18]、降血脂[19]等多種藥理作用。大蒜油成分主要以硫醚類（二烯丙基硫醚（allyl sulfide，DAS）、二烯丙基二硫醚（allyl disulfide，DADS）、二烯丙基三硫醚（allyl trisulfide，DATS）為主，還包括少量的噻吩類阿霍烯類[20]等。以硫醚為代表的脂溶性硫化物在抗凝血方面的研究還鮮有報道。本研究從大蒜中分離提取大蒜油，通過紫外光譜、分子熒光光譜、動力學分析等探究大蒜油及其主要成分的抗凝血作用，旨在為大蒜油抗凝血功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

48 只6～8 周齡SD大鼠，平均體質量為（220.0±4.5）g，由沈陽陸軍總院動物實驗室提供并飼養，使用許可證號：SYXK（遼）2018-0009。大鼠喂養及干預期間自由飲水，12 h/12 h明暗周期，動物房溫度為（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%。動物處理及飼養條件按照動物福利的相關規定及《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理辦法》實施。

大蒜 沈陽農業大學農貿市場；凝血酶 安徽經科公司；凝血酶發色底物S2238 上海源葉公司；DAS、DADS、DATS 沈陽農業大學食品化學實驗室；谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶（glutathion reductase，GR）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、總蛋白（total protein，TP）定量試劑盒 南京建成研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；CA1500全自動血凝分析儀 日本SYSMEX公司。

1.3 方法

1.3.1 大蒜油的制備

參考文獻[21]制備大蒜油。200 g大蒜加入200 mL蒸餾水，勻漿2～3 min并37 ℃攪拌4 h，令蒜氨酸酶與底物接觸，使脂溶性硫化物充分形成。含有大蒜油的溶液進一步加熱至沸騰，經冷凝管后形成油-水混合物餾出，靜置分層取油相，得到大蒜油。

1.3.2 大蒜油氣相色譜-質譜聯用分析

地方政府官員微博不僅要及時公布自己的行程，讓網民了解官員的日常生活狀態，知道官員都干了些什么，還要將自己職權范圍內可以公開的所在機構的最新動向公布到微博上，使網民更好地了解這些部門的工作情況。在表達個人意見和觀點的同時，官員要準確把握官員個人和公職身份之間的關系，避免發布與自身身份相沖突的個性化觀點，特別要注意不能挑戰社會常識和倫理底線。官員應了解民眾的需求，敢說敢言，面對網友的質疑應積極應對，多做解釋，盡量避免與網友的激烈爭辯，在無法解決問題時，政府官員應主動“休戰”，做到求同存異。

參考文獻[22]，用乙酸乙酯溶液配制大蒜油劑量為10 μL/mL的混合液體，經0.22 μm過濾膜過濾后進行氣相色譜-質譜聯用分析。色譜柱：DB-17MS（30 m×0.25 μm）；進樣量：1 μL；分流比：1∶50；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：He（純度99.999%）；流速：4.0 mL/min；電子轟擊離子源：70 eV；離子源溫度：30 ℃；四極桿溫度：450 ℃；升溫程序：90 ℃保持1 min后以13 ℃/min速率升溫至250 ℃，保持3 min。

1.3.3 凝血酶活力測定

參考文獻[23]測定凝血酶活力。大蒜油原液、DAS、DADS、DATS經2%（體積分數）乙醇溶液溶解，其中大蒜油原液分別稀釋102、103、104倍，DAS、DADS、DATS分別制成濃度為1.0、2.5、5.0 mmol/L溶液，將上述液體分別與質量濃度為1 mg/mL的凝血酶溶液以1∶1（V/V）混勻，37 ℃放置30 min，作為酶處理液。

凝血酶活力檢測體系（3 mL）：0.2 mL凝血酶發色底物S2238（1 mmol/L）、10 μL酶處理液，用0.1 mol/L pH 8.4 Tris-HCl緩沖液補足至3 mL，以10 s為間隔，記錄405 nm波長處吸光度，吸光度越高，酶活力越強。

1.3.4 分子熒光光譜分析

凝血酶（4 mg/mL、0.2 mL）分別與大蒜油、DAS、DADS、DATS（5 mmol/L、0.2 mL）以1∶1（V/V）混勻，37 ℃水浴30 min，激發波長280 nm，掃描300～800 nm處的熒光光譜。

1.3.5 分子對接

1.3.6 動物分組和血液樣本采集

參考文獻[25-26]進行分組和注射操作。將大鼠隨機分成6 組，每組8 只，包括空白組、對照組（橄欖油）、大蒜油組、DAS組、DADS組和DATS組。以100 μmol/（kgmb·d）劑量對大鼠連續3 d進行腹腔注射，第4天進行頸動脈采血，進行抗凝血指標（凝血四項）的檢測，剩余血液樣品于-80 ℃保存，用于抗氧化指標的測定。

1.3.7 凝血四項的檢測

采用全自動血凝儀分析凝血四項（PT、TT、APTT、FIB質量濃度）：將0.3 mL濃度為1.109 mmol/L枸緣酸鈉溶液與0.3 mL待測血液樣品混合，10 000 r/min離心15 min，離心后取血漿檢測凝血四項。

1.3.8 抗氧化指標測定

將血液樣品以10 000 r/min離心10 min得到血清，分別用GSH、GR、TP、T-AOC試劑盒測定抗氧化指標GSH、GR、TP、T-AOC水平。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 8.5軟件繪圖，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。數據采用平均值±標準差表示，結果進行正態性和方差同質性檢驗，采用t檢驗進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 大蒜油氣相色譜質-譜聯用分析結果

如圖1所示，大蒜油分別在6.5、8.5、10.3 min處存在3 個色譜峰，經面積歸一化分析，總硫醚含量大于90%。定性分析可以看出，質荷比（m/z）41、73、114、146、178是主要碎片。m/z114（Ma）、m/z146（Mb）和m/z178（Mc）分別為DAS（C6H10S，114.21）、DADS（C6H10S2，146.26）和DATS（C6H10S3，178.33）的分子離子碎片。m/z41（對應CH2＝CH-CH2-）和m/z73（對應CH2＝CH-CH2-S-）是以上3 種物質的共有碎片[27]。

圖1 大蒜油總離子流圖及質譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram and mass spectrum of crude garlic oil

2.2 大蒜油、DAS、DADS、DATS對凝血酶活性的影響

大蒜及其不同的制劑可以抑制交原刺激的血小板聚集，表現出抗凝血作用[28]。如圖2所示，本研究利用大蒜油、DAS、DADS、DATS與凝血酶進行相互作用后檢測凝血酶活性的變化，不同濃度硫化物對凝血酶活性有部分抑制作用，且存在濃度依賴關系，濃度越高，活性抑制越強。進一步以DAS、DADS、DATS與凝血酶作用，1～5 mmol/L濃度范圍均對酶活性起到部分抑制效果，其中DATS作用最強，DADS次之，DAS最弱（圖2B～D）。

圖2 大蒜油（A）、DAS（B）、DADS（C）、DATS（D）對凝血酶活性的影響Fig.2 Effects of garlic oil (A), DAS (B), DADS (C) and DATS (D) on thrombin activity

2.3 酶動力學分析結果

利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法進行酶動力學分析，結果如圖3所示，經DAS、DADS、DATS處理的凝血酶，Vmax和Km同時發生變化，將直線交點不在橫坐標軸上和縱坐標軸上的情況判定為混合型抑制（或共同型抑制）[29-30]，說明該抑制作用屬于競爭性和非競爭性的共同型抑制。這意味兩種作用方式產生抑制：即與底物競爭酶結合部位方式以及與酶的非活性部位結合形成抑制物-酶復合物的方式，不影響酶與底物的再次結合[29-30]。

圖3 DAS（A）、DADS（B）、DATS（C）酶動力學Lineweaver-Burk圖Fig.3 Lineweaver-Burk plots for DAS (A), DADS (B) and DATS (C)

2.4 熒光分析及分子對接分析結果

Trp、Tyr、Phe在300～400 nm波長處熒光變化可以反映蛋白質周圍環境變化導致的立體結構改變[31]。如圖4A所示，處理后的凝血酶，346 nm波長處處熒光強度降低，且位置和峰形不變，說明大蒜油、DAS、DADS、DATS都能不同程度地與酶發生作用，結合圖2分析可知，大蒜油中起到酶活性抑制的物質主要是DADS和DATS，它們單獨的作用效果要優于大蒜油和DAS單獨作用的效果。如圖4B所示，隨著DATS濃度增加，346 nm波長處熒光強度逐漸降低，說明DATS與酶蛋白中發色基團相互作用發生熒光猝滅。在本實驗條件下，大蒜油、DAS、DADS、DATS本身無熒光。

進一步利用分子對接技術深入探討DATS對凝血酶三維結構[PDBID：1ETT]相互作用機制。利用三維分子對接技術，DATS與凝血酶的結合能為-4.55 kJ/mol，屬自發反應，結合性能良好（圖4C）。利用二維分子對接技術，DATS中心位置的硫原子能與酶分子活性位點氨基酸殘基Asp189、Gly219和Ala190中的氧原子形成氫鍵，鍵長分別為3.06、3.11 ?和2.97 ?，與活性位點氨基酸殘基Gly216、Ser195、Trp215形成疏水作用力（圖4D），以上氫鍵及疏水作用力提供了競爭性抑制。DATS與酶分子非活性位點周圍的Gly226、Asp221A、Tyr225、Glu217、Cys191、Val213形成疏水作用力（圖4D），提供了非競爭性抑制[32-33]。分子對接結果與動力學結果一致。

圖4 大蒜油、DAS、DADS、DATS與凝血酶的作用機制Fig.4 Action mechanisms of garlic oil, DAS, DADS and DATS on thrombin

2.5 大鼠體內實驗分析結果

2.5.1 凝血四項指標分析結果

如表1所示，與空白組相比，大蒜油、DAS、DADS、DATS處理組的PT、APTT和TT均出現顯著增高的趨勢，其中DATS組極顯著升高（P＜0.01），說明大蒜油、DAS、DADS、DATS均是通過改變內源性（APTT）、外源性（PT）、共同凝血途徑（TT）凝血系統而起到抗凝作用；大蒜油、DAS、DADS、DATS組FIB質量濃度極顯著下降，分別從（2.13±0.66）g/L降低至（1.48±0.23）、（1.54±0.48）、（1.31±0.35）、（1.16±0.13）g/L，說明大蒜油、DAS、DADS和DATS干預可以降低大鼠血液FIB含量從而發揮抗凝血活性。綜合圖2和圖3結果可知DADS和DATS是大蒜油中主要的抗凝血硫化物，且DATS的抗凝血效果更優于DADS。

表1 大蒜油、DAS、DADS、DATS對大鼠凝血四項的影響Table 1 Effects of garlic oil, DAS, DADS and DATS on blood coagulation parameters in rats

2.5.2 抗氧化與抗凝血能力

如圖5所示，大蒜油、DAS、DADS、DATS處理組的GSH、GR、TP、T-AOC水平均比空白組略有升高，但都不具有顯著性差異（P＞0.05）。這說明大蒜油、DAS、DADS、DATS只有微弱的抗氧化能力，與大蒜油、DAS、DADS、DATS具有顯著抗凝血能力的結果并不一致。因此，本實驗所揭示的大蒜油、DAS、DADS、DATS抗凝血能力應該與其抗氧化能力無關。

圖5 大蒜油、DAS、DADS、DATS對大鼠血清抗氧化指標的影響Fig.5 Effects of garlic oil, DAS, DADS and DATS on serum antioxidant indexes of rats

3 結 論

本研究通過體內和體外實驗探索了大蒜油、DAS、DADS、DATS的抗凝血功能，紫外光譜、分子熒光光譜、動力學分析結果表明DAS、DADS、DATS對凝血酶的抑制作用屬于競爭性/非競爭的共同抑制效果；二維、三維分子對接分析結果表明抑制屬競爭性和非競爭抑制并存的作用方式；大鼠凝血四項的結果從體內的角度印證了大蒜油、DAS、DADS、DATS具有抗凝血功能；大鼠抗氧化實驗結果提示大蒜硫醚類抗凝血功能應與抗氧化能力不相關。