秦川牛肉冷藏期間能量代謝變化及其對肉品質的影響

羅 輝，何雨薇，張杏亞，阮振甜，羅瑞明，李亞蕾*

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

動物宰后細胞中的線粒體不會立刻停止活動，繼續保持活力并消耗氧。線粒體具有氧化磷酸化、參與三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環、能量轉化和鈣離子儲存等代謝功能[1]。宰后畜禽肌肉轉化為食用肉需經過一系列生理生化的熟化過程，線粒體執行代謝功能，其中代謝酶和氧化還原酶等蛋白在其中發揮著重要作用。肉品質形成及變化與能量物質及伴隨產能生成的產物相關，能量基礎物質對肌紅蛋白表達、分子穩定及3 種衍生態的轉化起決定性作用[2]，無氧糖酵解過程在產能的同時也會產酸，導致肌肉酸化的問題[3]。

近年來，國內外學者對線粒體能量代謝調控方面進行了一定的研究。楊玲等[4]研究細胞中線粒體蛋白ISCA2低表達對三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）代謝的影響，結果表明，線粒體蛋白ISCA2低表達后，線粒體呼吸鏈復合體中鐵硫蛋白亞基出現不同程度下調，鐵硫簇組裝被抑制，導致鐵硫蛋白功能障礙，影響線粒體復合體活性和氧化磷酸化系統，造成細胞能量代謝紊亂。Postnikova等[5]研究指出氧合肌紅蛋白通過與線粒體相互作用脫氧，缺氧會誘導多種增加能量產生的補償機制發生。Lavie等[6]研究琥珀酸脫氫酶亞基A的泛素蛋白酶體系統（ubiquitin proteasome system，UPS）依賴性降解及其對線粒體能量代謝的生理影響，證明多種氧化磷酸化蛋白的轉化率依賴于UPS，線粒體能量代謝發生紊亂會造成活性氧堆積過多、電子傳遞鏈損傷、線粒體動力學受損、生物能量失衡、線粒體鈣離子堆積等。在能量物質對肉品質影響的研究中，藏磊等[7]以H2O2活性氧清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸、H2O2+腺苷一磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）抑制劑處理的牦牛肉背最長肌為對象，研究活性氧誘導AMPK通路對宰后牦牛肉成熟過程中糖酵解及肉品質的影響，發現能量代謝與肌肉質量及肉制品營養價值相關。

秦川牛作為國內陜甘寧地區的優勢特色畜種，近5 年來年均存欄數約300萬 頭，年均出欄數約100萬 頭，年均肉產量約50萬 t[8]，且肉質細致、肉味濃厚、瘦肉比例高、營養均衡，深受消費者喜愛[9]。非標記定量（label-free quantitative，LFQ）蛋白質組學技術不依賴于同位素標記，該技術通過液相色譜-質譜聯用法，分析蛋白酶解肽段的信號強度進行相對定量[10]。在3D蛋白質組學根據保留時間、質荷比（m/z）、離子強度3 個維度的基礎上，加入離子淌度作為第4維度，離子淌度主要根據離子的形狀和截面進行分離，為復雜體系樣品的測定帶來更多可能[11-13]。為探究秦川牛肉冷藏期間能量代謝變化機理及其對肉品質的影響。采用4D-LFQ蛋白質組學技術，利用Wolfpsort軟件預測蛋白的亞細胞結構定位，篩選線粒體定位的差異蛋白。使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測能量基本物質一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）等的含量，并進行相關性分析，篩選與能量代謝相關的差異蛋白，再進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析和蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析。研究在不同貯藏期冷鮮牛肉中線粒體定位蛋白中能量代謝相關差異蛋白，分析所得差異蛋白涉及到的信號通路，以期從線粒體定位蛋白的表達豐度變化闡明宰后肌肉組織能量代謝障礙的機制，為進一步探索能量代謝紊亂對肌肉肉色穩定性和酸化的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 月齡秦川公牛 甘肅省平涼市涇川縣旭康食品有限責任公司。

三乙基碳酸氫銨（色譜純）、尿素（色譜純）、碘代乙酰胺（色譜純）、三氟乙酸 美國Sigma公司；胰酶（Ref：V5111） 美國Promega公司；混合蛋白酶抑制劑 Calbiochem（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎機 那艾精密儀器（上海）有限公司；CR-400便攜式色差儀 日本柯尼卡-美能達公司；205便攜式pH計 德國Testo公司；MiniVac Alpha冷凍離心機美國ScanSpeed公司；timsTOF Pro質譜儀、NanoElute HPLC儀 德國Bruker 公司；-80 ℃超低溫冰箱美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選取9 頭25 月齡生長發育狀態良好、健康無病秦川公牛。采樣前用體積分數75%乙醇溶液對取樣工具進行消毒處理。屠宰后修整牛胴體，用去離子水沖洗，選取背最長肌，每頭牛取3 個平行，共27 個樣品。所有樣品均分割成塊狀置于聚乙烯薄膜（透氣性23.5 g/（m2·d））內，于0～4 ℃冰箱中貯藏。樣品分為3 組，分別在貯藏0、4 d和8 d時取出，立即放入液氮中冷凍2 h，再置于-80 ℃冰箱中貯藏，待后續檢測分析使用。

1.3.2 背最長肌中能量基本物質ATP、ADP、AMP、NADH含量的測定

稱取約50 mg樣品于EP管中，加入1 mL預冷（4 ℃）混合液（1 mmol/L乙二胺四乙酸+0.6 mol/L高氯酸），充分勻漿2 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液500 μL，過膜后于-80 ℃冰箱中保存。參考洪平等[14]的方法采用HPLC法檢測ATP、ADP、AMP、NADH含量。色譜條件：流動相為220 mmol/L硫酸鉀緩沖液，內含體積分數10%甲醇，用四丁基氫氧化銨調節pH值至6.5，等比洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm。

1.3.3 肉色測定

參考D’Alessandro等[15]的方法并進行修改，采用色差儀，經白板校對后檢測肉樣亮度（L*值）、紅度（a*值）、黃度（b*值）。測定前用濾紙吸去肉樣表面水分，每塊肉樣取3 個不同點進行測定，結果取平均值。

1.3.4 pH值測定

參照左惠心[16]的方法，先將pH計用pH 4.01、6.86和9.18的緩沖溶液校對，然后順肌纖維方向插入肉樣內部，取3 個不同點進行測定，結果取平均值。

1.3.5 4 D-LFQ蛋白質組學技術檢測蛋白含量

取適量樣品放入液氮預冷后的研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀。再加入樣品體積4 倍的裂解緩沖液（8 mol/L尿素+1%蛋白酶抑制劑），超聲裂解后放入低溫離心機中，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

向上述蛋白溶液中添加二硫蘇糖醇溶液至蛋白濃度為5 mmol/L，置于56 ℃環境下還原30 min。再加入100 mmol/L碘代乙酰胺溶液使其終濃度為11 mmol/L，室溫避光環境下靜置12 min。為避免裂解液中尿素影響胰酶活力，需用四乙基溴化銨溶液將蛋白樣品溶液中尿素濃度稀釋至2 mol/L以下。按照蛋白質量的2%添加胰酶，37 ℃酶解12 h后，再按照蛋白質量的1%添加胰酶，37 ℃酶解4 h。酶解完成后使用C18固相萃取小柱萃取肽段。

HPLC-質譜聯用檢測條件：流動相A為含體積分數0.1%甲酸的乙腈溶液，流動相B為體積分數0.1%甲酸水溶液。洗脫程序：0～3 min、4%～6% A，4～70 min、6%～25% A，71～82 min、25%～32% A，83～87 min、32%～80% A，88～90 min、80%～100% A；流速300 nL/min。采用流動相B溶解肽段，NanoElute超高效液相系統進行分離。肽段分離后注入到Capillary離子源（電壓1.4 kV）中進行電離，使用飛行時間質譜對肽段母離子及其二級碎片進行檢測和分析，掃描范圍m/z100～1700。平行累積串行碎裂（parallel accumulation serial fragmentation，PASEF）模式進行數據采集。一級質譜采集后進行PASEF模式采集母離子電荷數在0～5范圍內的二級譜圖，采集次數10 次。為避免母離子的重復掃描，串聯質譜掃描的動態排除時間設置為24 s。

1.3.6 數據庫搜索

使用Maxquant v1.6.6.0對實驗中所得二級質譜數據進行檢索。檢索參數設置如下：選擇Bos_taurus_9913_PR_20190915.fasta（37 948 條序列）作為數據庫，加入常見的污染庫消除鑒定結果中污染蛋白的影響，加反庫消除計算隨機匹配造成的假陽性率影響；Main Search與First Search的一級母離子質量誤差容忍度均設為40×10-6Da，二級碎片離子質量誤差容忍度設為0.04 Da；肽段最大修飾數、漏切位點數和肽段最小長度分別設置為5、2和7；酶切方式為Trypsin/P。固定修飾為半胱氨酸烷基化，可變修飾為蛋白N端的乙?；图琢虬彼岬难趸?。肽匹配圖譜鑒定的假陽性率和蛋白匹配率均設置為1%。

1.3.7 生物信息學分析

用Wolfpsort軟件預測蛋白的亞細胞結構定位，篩選出線粒體定位的豐度差異蛋白，利用KEGG數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）檢索途徑對能量代謝相關的線粒體定位差異蛋白進行生物信息學分析。通過String 10.0網站（http://string-db.org/）繪制差異蛋白PPI網絡圖。

1.4 數據處理與分析

所有實驗結果均以平均值±標準差表示。運用SPSSAU統計軟件分析線粒體定位差異白質與能量代謝指標間的Pearson相關性。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間秦川牛背最長肌線粒體定位差異蛋白的確定

采用4D-LFQ蛋白質組學方法測定秦川牛宰后貯藏過程中蛋白質組的變化，共鑒定得到1 149 種蛋白，以差異倍數大于1.2為標準，篩選鑒定出120 種豐度差異蛋白。利用Wolfpsort軟件預測亞細胞結構定位，KEGG數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）檢索途徑對能量代謝相關的線粒體定位蛋白進行生物信息學分析，共鑒定出21 種線粒體定位的差異蛋白，具體如表1所示。

表1 不同貯藏時間秦川牛背最長肌線粒體定位差異蛋白篩選結果Table 1 Differentially located proteins in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle at different storage periods

2.2 不同貯藏時間秦川牛背最長肌中能量基本物質含量

如表2所示，隨著貯藏時間延長，ATP含量呈極顯著或顯著下降趨勢（P＜0.01、P＜0.05），貯藏4 d時背最長肌中仍含有一定量高活性的ATP酶[17]，ATP含量迅速降低，但ATP含量仍有（1.20±0.45）μmol/g，之后緩慢下降，至貯藏8 d時降低至（0.50±0.20）μmol/g，這可能是由于隨貯藏時間的延長，ATP酶變性失活。ADP、AMP含量在貯藏0～8 d期間也呈極顯著或顯著下降趨勢（P＜0.01、P＜0.05），牛宰后肌肉組織中ATP進行不可逆降解，即ATP→ADP→AMP[18]，隨著ATP含量的降低，ADP、AMP含量逐漸降低。NADH含量變化反映了細胞內能量變化和氧化還原狀態。貯藏過程中NADH含量逐漸降低，原因可能是貯藏期間線粒體結構受損、功能失調，呼吸功能中斷，導致NADH含量顯著下降。張同剛[19]研究畜禽宰后肌肉組織中NADH含量變化，結果表明貯藏時間的延長導致NADH含量逐漸降低，且貯藏7 d后幾乎無法檢測到NADH，與本實驗結果一致。該結果提示隨著貯藏時間的延長，牛背最長肌中能量代謝發生變化，氧化還原狀態發生紊亂。

表2 不同貯藏時間秦川牛背最長肌中ATP、ADP、AMP、NADH含量Table 2 Contents of ATP, ADP, AMP and NADH in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle at different storage periods μmol/g

2.3 線粒體定位差異蛋白表達豐度與能量代謝物質含量的相關性

采用SPSSAU軟件進行Pearson相關性分析，根據線粒體定位差異蛋白表達豐度與能量代謝指標（ATP、ADP、AMP、NADH含量）的相關系數發現，表2中大部分差異蛋白的表達豐度與肉的能量代謝物質含量相關，其中相關系數絕對值大于0.5的蛋白有6 種（表3）。ATP5F1D、ATP5F1C表達豐度與ATP、ADP含量呈極顯著負相關（P＜0.01）；NDUFB5表達豐度與ATP、NADH含量呈顯著負相關（P＜0.05）；NDUFA6表達豐度與ATP含量呈顯著負相關（P＜0.05），與NADH含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；SUCLA2表達豐度與ADP、AMP含量呈顯著正相關（P＜0.05），與ATP、NADH含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。COX7A1表達豐度與ATP、ADP含量呈顯著負相關（P＜0.05）。表明宰后貯藏過程中，線粒體定位的6 種差異蛋白與能量代謝密切相關。

表3 線粒體定位差異蛋白表達豐度與ATP、ADP、AMP、NADH含量的Pearson相關性Table 3 Pearson correlation between mitochondrial localization differential protein expression abundance and contents of ATP, ADP,AMP and NADH

2.4 能量代謝相關的線粒體定位差異蛋白的生物信息學分析結果

圖1為與能量代謝相關的線粒體定位差異蛋白的PPI網絡圖，該網絡中PPI富集的P值為1.68×10-11，聚類系數為0.861。ATP5F1D、ATP5F1C、NDUFA6、NDUFB5、SUCLA2相互作用強烈，形成互作網絡，ATP5F1D和COX7A1存在共表達作用，圖中有4 條反應途徑顯示豐富，主要參與TCA循環和呼吸電子傳遞、嵴的形成、通過化學滲透耦合進行ATP合成以及通過解偶聯蛋白產生熱量，在代謝通路中發揮著重要作用[20]。

圖1 能量代謝相關的線粒體定位差異蛋白的PPI網絡圖Fig.1 PPI network diagram of mitochondrial localization differential proteins related to energy metabolism

通過KEGG注釋代謝通路分析發現，6 種線粒體定位差異蛋白參與了8 條生物信號通路，差異蛋白主要富集在氧化磷酸化（bta00190）、代謝途徑（bta01100）、生熱反應（bta04714）等相關代謝通路中。為探究秦川牛肉宰后冷藏期間能量代謝變化對其品質的影響，本實驗僅對與ATP的產生和消耗密切相關的氧化磷酸化代謝通路進行闡述。氧化磷酸化代謝通路中差異蛋白表達的變化如圖2所示。差異蛋白主要參與線粒體電子傳遞、線粒體呼吸鏈復合物I裝配、ATP生物合成等過程。根據KEGG基因名稱可知，上調蛋白ATP5F1D為F型H+運輸ATP酶亞基δ，ATP5F1C為F型H+運輸ATP酶亞基γ，主要參與ATP生物合成。上調蛋白NDUFA6、下調蛋白NDUFB5均為NADH脫氫酶亞基，兩者共同參與線粒體呼吸鏈復合物I的裝配。下調蛋白COX7A1為細胞色素c氧化酶亞基7A，調控線粒體呼吸鏈復合物IV的活性。下調蛋白SUCLA2為琥珀酸-CoA合成酶[ADP形成]亞基，在ATP合成和水解過程中有重要作用。以上6 種蛋白共同參與氧化磷酸化代謝通路，影響線粒體電子的傳遞。

圖2 氧化磷酸化代謝通路中線粒體定位差異蛋白表達豐度的變化Fig.2 Variation in abundance of mitochondrial localization differentially expressed proteins in oxidative phosphorylation metabolic pathway

2.5 線粒體定位差異蛋白對能量代謝的影響機理

ATP5F1D和ATP5F1C分別為ATP合酶亞基δ和亞基γ。ATP合酶能夠利用電子梯度和相關膜電勢合成ATP，在連接質子轉位和ATP合成過程中起重要作用[21]。F1F0型ATP合成酶是能量交換的關鍵酶[22]，由兩個結構域組成（圖3）：蘑菇頭部分F1位于線粒體基質側，由5 個亞基（α3、β3、γ1、δ、ε1）組成，具有與底物結合的協調作用機制，同時具有ATP合酶的催化活性；蘑菇莖部分F0大部分嵌在線粒體內膜中，承擔離子通道作用[23]。

圖3 ATP合酶結構示意圖[24]Fig.3 Schematic diagram of ATP synthase structure[24]

ATP合酶可以合成也可消耗ATP。ATP合酶的γ亞基每旋轉360°的同時合成3 分子的ATP。當ATP合酶逆向轉動，ATP被水解成ADP和磷酸基團（Pi），同時消耗能量將質子從線粒體基質反向泵入線粒體膜間隙。本研究中氧化磷酸化信號通路所涉及的差異蛋白ATP5F1D、ATP5F1C，屬于F1部分，ATP5F1D、ATP5F1C表達豐度均與ATP含量呈極顯著負相關（P＜0.01），ATP5F1D表達豐度在貯藏第4天較第0天上調了1.819 倍，貯藏第8天較第0天上調了1.516 倍，ATP5F1C表達豐度在第8天較第0天上調了1.579 倍（表1）。隨著貯藏時間的延長，ATP5F1D、ATP5F1C表達豐度改變，導致關鍵酶ATP合成酶不能正常發揮其功能，細胞不能正常交換能量，這是宰后細胞能量代謝紊亂的重要機制。

SUCLA2為琥珀酸-CoA合成酶[ADP形成]亞基，琥珀酰輔酶A合成酶（succinyl-CoA synthetase，SUCL）參與TCA，琥珀酰輔酶A在琥珀酸硫激酶作用下使高能硫酯鍵水解，將能量轉移至二磷酸鳥苷生成三磷酸鳥苷及琥珀酸，生成的三磷酸鳥苷可直接利用，也可將Pi轉移給ADP生成ATP[25]，琥珀酰輔酶A的水解與ATP的合成偶聯，是TCA中底物水平磷酸化的唯一代表步驟。SUCL是一個異構二聚體，由一個固定的α亞基SUCL-α和一個底物特異性的p亞基組成，p亞基可提供核苷酸特異性并與底物琥珀酸結合[26]，由SUCLA2基因編碼的A-SUCL-β與SUCL-a結合可以合成ATP。貯藏期間SUCLA2表達豐度隨貯藏時間的延長下調。SUCLA2低表達后SUCL活性降低。本實驗中，隨著貯藏時間的延長，背最長肌ATP、NADH含量均出現不同程度的降低，SUCLA2表達豐度與ATP、NADH含量呈極顯著正相關（P＜0.01），由此說明，SUCLA2低表達造成細胞氧化磷酸化水平降低，影響能量的生成。

NDUFB5、NDUFA6為NADH脫氫酶的亞復合物亞基，NADH脫氫酶位于線粒體內膜呼吸鏈中，催化電子從NADH傳遞給輔酶Q，是線粒體電子傳遞鏈中的復合體I，被稱為氧化磷酸化的“入口酶”[27]。NDUFB5表達豐度與NADH含量呈顯著負相關（P＜0.05）。NDUFA6表達豐度與NADH含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。本實驗中NDUFA6表達豐度在貯藏4 d后呈上調趨勢，第4天是第0天的1.467 倍，NDUFB5表達豐度在貯藏0～4 d期間差異不顯著，之后呈下調趨勢，貯藏第8天較第4天調整0.497 倍。NDUFB5、NDUFA6主要參與的反應途徑為復合物I的生物發生（bta6799198）。在生成復合物I的反應途徑中，中間產物II與mt-ND1/NDUFAFS/NDUFAF6復合物結合形成315 kDa亞復合物，ND2、ND3、ND6、NDUFB5結合MCIA復合物形成370 kDa亞復合物。NDUFB5、NDUFA6參與電子呼吸鏈中復合物I的裝配，楊玲等[4]研究發現復合體I亞基水平在貯藏8 d后出現不同程度的降低，亞基蛋白的低表達影響電子在線粒體呼吸鏈中的正常傳遞。在本實驗中，隨著貯藏時間延長，ATP含量快速下降，表明NDUFB5的低表達導致細胞氧化磷酸化水平下降，影響能量的釋放。

COX7A1是細胞色素c氧化酶亞基7A1，細胞色素c氧化酶位于線粒體內膜上，處于線粒體電子傳遞鏈的末端[28]，將呼吸底物的電子經過細胞色素系統直接傳遞給分子態氧，將氧還原成水。細胞色素c氧化酶活力能夠控制線粒體呼吸鏈的電子傳遞能力，從而控制線粒體偶聯的效率，以及活性氧的產生。細胞色素c氧化酶含有多個金屬輔因子和亞基，其中COX1、COX2和COX3亞基參與形成催化反應中心，由細胞核基因編碼的COX4、COX5a、COX6a、COX7a和COX8等13 個亞基指導細胞色素c氧化酶在線粒體內正確裝配，同時維持細胞色素c氧化酶構象穩定[29]。本實驗中COX7A1表達豐度在貯藏第8天較第4天調整了0.692 倍，COX7A1的低表達會導致細胞色素c氧化酶亞基缺失，質子通道以及氧化還原中心結構的裝配發生錯誤，造成細胞色素c氧化酶結構紊亂，線粒體功能缺失，不能正常傳遞質子，氧化磷酸化受到抑制，導致細胞中能量轉移不能正常進行，從而影響宰后肌肉組織的能量代謝。

2.6 秦川牛宰后由于能量代謝引起的肌肉品質變化

2.6.1 肉色

宰后貯藏過程中，牛肉顏色會發生顯著變化。如圖4所示，L*值反映肉品的亮度，L*值在貯藏0～4 d呈上升趨勢，貯藏4～8 d呈緩慢下降趨勢。a*值反映肉品的紅度，貯藏過程中a*值極顯著降低，從第0天的23.77下降至第8天的10.27。b*值反映肉品的黃度，b*值在貯藏0～8 d呈緩慢上升趨勢，從第0天的12.46增長至第8天的14.87。

圖4 不同貯藏時間秦川牛背最長肌肉色的變化Fig.4 Effect of storage time of on meat color Longissimus dorsi of Qinchuan cattle

生鮮肉變色的主要原因是高鐵肌紅蛋白（methemoglobin，MetMb）的積累，因此降低MetMb含量對保持生鮮肉色澤至關重要，肌紅蛋白3 種衍生態能量大小不同，依次為脫氧肌紅蛋白（deoxy-myoglobin，DeoMb）＞MetMb＞氧合肌紅蛋白（oxy-myoglobin，OxyMb），3 種肌紅蛋白更易由能量高向能量低的狀態轉化[9,30]。MetMb到DeoMb的反應為吸熱反應，需要ATP參與，SUCLA2、ATP5F1D蛋白異常表達降低了細胞氧化磷酸化水平，本實驗中背最長肌ATP含量在宰后貯藏第4天時較第0天降低了88.2%，ATP含量大量減少，造成MetMb向DeoMb轉化的反應難以進行，從而導致MetMb累積，肉色發生褐變[31]。有學者研究表明，NADH的氧化速率與MetMb的形成速率有關[32]，NADH含量越高，MetMb含量積累量也就越多[33]，而隨著肌肉中MetMb含量逐漸增加，a*值呈現下降趨勢[34]，這與表4中a*值與NADH含量呈極顯著正相關的結果一致。NDUFA6和NDUFB5蛋白的異常表達降低了NADH脫氫酶活力，從而使NADH積累，本實驗中背最長肌NADH含量在貯藏第4天時較第0天僅降低了26.1%，NADH含量相對較高，這表明MetMb大量積累，促使肉品發生褐變。綜上可以看出，能量物質的含量高低可以一定程度影響肉色的維持。

表4 貯藏期間秦川牛背最長肌色差與能量代謝指標的相關系數Table 4 Correlation coefficients between color difference values and energy metabolism indexes of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

2.6.2 肌肉酸化

秦川牛背最長肌宰后酸化程度可用pH值體現，如圖5所示，宰后秦川牛背最長肌pH值呈“V”型變化，從第0天的6.75下降至第4天的5.38，下降了20.3%；宰后第4天到第8天僅上升了5.8%。

圖5 不同貯藏時間秦川牛背最長肌pH值的變化Fig.5 Changes in pH of Qinchuan cattle Longissimus dorsi during storage

如表5所示，pH值與ATP、ADP含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與NADH呈顯著正相關（P＜0.05），與AMP無顯著相關性。屠宰前動物體的血液循環可以為肌肉組織提供所需氧氣，肌肉組織中糖代謝主要以有氧代謝的形式進行；而屠宰后血液循環停止，在氧供應不足的情況下，產無氧糖酵解反應開始活躍[3,34-35]。糖酵解在產生能量的同時會產生乳酸，導致肌肉pH值下降[36]。因此秦川牛宰后無氧糖酵解在產生ATP同時產生乳酸，進一步促進宰后牛肉的酸化。

表5 貯藏期間秦川牛背最長肌pH值與能量代謝指標的相關系數Table 5 Correlation coefficients between pH and energy metabolism indexes of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

2.6.3 肌肉嫩化

消費者在選擇牛肉時將嫩度作為判斷肉品質的重要因素，因此嫩度在一定程度上決定了肉品價值[16]。肉的嫩度可以通過剪切力和質構特性反映，肉在成熟過程中嫩度的改善和質構的變化主要歸因于肌肉肌原纖維蛋白的降解[37-38]，線粒體中的ATP是細胞凋亡過程中一個關鍵影響因素[39]，ATP的缺失會導致線粒體膜通透性轉運孔的開放和/或線粒體跨膜電位下降，導致細胞凋亡發生[40]。細胞凋亡會引發肌肉蛋白合成和降解速率失衡，使肌肉蛋白的合成速率遠低于降解速率，造成肌肉纖維蛋白含量減少，進而使牛肉的嫩度和質構發生變化[41]。貯藏期間秦川牛背最長肌質構特性與能量物質相關系數如表6所示，ATP含量與剪切力、硬度和彈性均呈極顯著正相關（P＜0.01），與內聚性和咀嚼度呈顯著正相關（P＜0.05）。王琳琳等[42]在研究宰后牦牛細胞凋亡對肌肉內環境與嫩度影響時也證明細胞凋亡對肌肉嫩化具有重要作用，這與Chen Lin等[43]的研究結論一致。綜上，能量物質ATP的含量對肉品的嫩度變化具有一定影響。

表6 貯藏期間秦川牛背最長肌質構特性與能量代謝指標的相關系數Table 6 Correlation coefficients between texture properties and energy metabolism indexes of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

3 結 論

采用4D-LFQ蛋白質組學技術對宰后秦川牛肉不同貯藏時間蛋白表達豐度進行分析，結果顯示，與能量代謝相關差異表達蛋白主要為氧化還原酶類和代謝酶類。秦川牛肉不同貯藏時間差異表達蛋白質對能量代謝存在不同程度的調控作用。能量物質含量的變化對肉品質產生一定影響。ATP含量的降低影響MetMb向DeoMb轉化，造成肉色褐變；肌肉酸化中糖酵解在產生能量的同時產生乳酸，導致肌肉酸化；ATP影響肌細胞的凋亡造成肌纖維蛋白降解，促進肌肉嫩化。因此通過一定措施降低宰后生理活動、減少能量消耗、降低能量的產生可以保證肉品質的穩定性。