脫落酸處理對蘋果成熟、乙烯合成及其信號轉導基因表達的影響

戚英偉，劉懸爍，丁毓端，姜永華，張玉潔，劉 佳，蔣紫洮，任小林,*

（1.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；3.廣東省農業科學院果樹研究所，農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；4.臨潼區林業工作站，陜西 西安 710600）

脫落酸（abscisic acid，ABA）在調控果實發育成熟方面具有重要作用。與乙烯調節呼吸躍變型果實的成熟不同，ABA在調節躍變型和非躍變型果實成熟中均起著正向調節作用，并且ABA在調節非躍變型果實成熟中起著主導作用[1-3]。ABA在調控躍變型果實成熟方面同樣發揮重要作用，并且與乙烯誘導的果實成熟關系密切。研究發現，外源ABA處理能夠通過調控1-氨基環丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthase，ACS）和1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid oxidase，ACO）基因的表達誘導乙烯生成，進而促進番茄果實的成熟[4]。而通過外源化學物質去甲二氫愈創木酸和1-甲基環丙烯處理或者通過分子生物學手段抑制番茄果實ABA的生物合成和信號轉導可延遲果實的成熟[5-7]。類似地，Zaharah等[8]研究發現，ABA通過提高乙烯合成酶（ACS和ACO）活性促進乙烯的生物合成，進而加速芒果果實的采后成熟軟化。

蘋果果實是典型的呼吸躍變型水果，乙烯在蘋果采后成熟過程中具有至關重要的作用。之前的研究表明，外源ABA處理能夠影響蘋果果實發育和乙烯釋放[9-11]。Lara等[12]研究發現，‘Granny Smith’蘋果果皮中內源ABA可能通過提高ACO活性促進冷誘導過程中的乙烯合成。另一項研究發現ABA處理能夠顯著促進ACO合成，促進商業成熟期前2 個月的‘Granny Smith’蘋果乙烯合成；盡管ABA促進了商業成熟期前1 個月的蘋果1-(丙二酰氨基)環丙烷-1-羧酸和ACO的積累，但卻沒有影響蘋果乙烯合成[13]。

果實采后成熟衰老受到多種激素的共同作用。蘋果果實采后成熟衰老過程中果實硬度、果皮色澤、可滴定酸和可溶性固形物含量等發生劇烈變化。乙烯合成與乙烯信號轉導對蘋果果實的采后成熟衰老具有至關重要的作用。目前，對ABA如何參與蘋果果實采后成熟衰老的認知有限。已有的研究多關注ABA對蘋果乙烯生成的影響，而對ABA處理的蘋果果實采后成熟過程中伴隨的復雜生理生化變化關注較少。同時，ABA處理如何影響蘋果乙烯信號轉導尚不清楚?；诖?，本實驗以‘Granny Smith’蘋果為試材，研究ABA對蘋果果實采后成熟過程中硬度、果皮葉綠素含量、乙烯生物合成和乙烯信號轉導的影響，為進一步研究ABA如何參與蘋果果實采后成熟衰老提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業成熟期前一個月（花后120 d）的‘Granny Smith’蘋果采自千陽蘋果試驗站（陜西）。選擇無病蟲害、無機械傷且大小均勻的蘋果果實為實驗材料。

PrimeScript? RT reagent Kit、SYBR?Premix ExTaq? II和Plant RNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司；ABA含量酶聯免疫試劑盒 中國農業大學；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GS-15果實質地分析儀 南非GUSS Manufacturing (Pty)公司；GMK-835F型酸度計 韓國G-won Hitech公司；FULI 9790II氣相色譜儀 浙江福立分析儀器股份有限公司；1730R高速冷凍離心機 丹麥LaboGeneTM公司；DYY-6D瓊脂糖凝交電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GeneGenius凝交成像儀 美國Syngene公司；Infinite 200 PRO NanoQuant酶標儀 瑞士Tecan公司；Icycler IQ5定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司；A11高速研磨儀德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 ABA處理

取‘Granny Smith’蘋果果實平均分成兩組，一組從果實萼端向果腔內注射1 mL 500 μmol/L ABA，另一組注射等量的無菌水。果實處理后倒置，于20 ℃條件下16 h光照/8 h黑暗靜置，貯藏45 d，分別于貯藏的第0、5、10、15、25、35、45天取樣測定各理化指標，每次測定9 個果實，設置3 次重復。取赤道部位的蘋果果肉，液氮速凍后置于-80 ℃。

1.3.2 乙烯產生速率測定

取3 個蘋果果實置于體積為9.8 L的干燥器，密封保持60 min。用注射器抽取容器內氣體，將1 mL抽取的氣體注入氣相色譜儀，按照Qi Yingwei等[14]的方法測定乙烯釋放速率，單位為μL/（g·h）。

1.3.3 ABA含量測定

參照張煒等[15]的方法提取蘋果果肉中的ABA。采用間接酶聯免疫吸附測定法測定樣品中的ABA含量，具體步驟按照試劑盒說明書執行。

1.3.4 可滴定酸質量分數和硬度測定

使用GMK-835F型酸度計測定蘋果果肉的可滴定酸質量分數。

使用果實質地分析儀，參照Qi Yingwei等[14]的方法測定蘋果果實的硬度，單位為kg/cm2。

1.3.5 纖維素酶和果交甲酯酶活力測定

參照劉耀娜[16]和南玉玉[17]等的方法測定纖維素酶（cellulase，Cel）和果交甲酯酶（pectin methylesterase，PME）活力。結果以果肉鮮質量計。

1.3.6 果皮葉綠素含量測定

按照Lichtenthaler[18]的方法提取并測定蘋果果皮葉綠素含量。取果皮，液氮速凍，置于高速研磨儀研磨至粉末狀。稱取1.0 g至10 mL離心管，加入4 mL體積分數80%丙酮溶液。超聲輔助提取30 min后于4 ℃、9 425×g離心5 min。重復一次超聲輔助提取、離心，合并上清液，得到葉綠素提取液。取上清液于663 nm和647 nm波長處分別測定吸光度。分別按照公式（1）、（2）計算葉綠素a、葉綠素b含量?？側~綠素含量為葉綠素a、葉綠素b含量之和。

式中：V表示提取液體積/mL；m表示果皮鮮質量/g。

1.3.7 基因相對表達量的測定

分別取貯藏0、5、10、15、20、25、30 d的樣品進行基因相對表達量的測定。使用Plant RNA Extraction Kit提取果肉RNA。微量紫外分光光度計檢測RNA濃度，質量分數1%瓊脂糖凝交電泳檢測RNA的完整性。取1 μg檢測合格的RNA，使用PrimeScript? RT reagent Kit反轉錄合成cDNA。采用試劑盒SYBR?Premix ExTaq? II和Icycler IQ5定量PCR儀進行定量分析。PCR反應體系：熒光染料10 μL、cDNA（100 ng/μL）1.5 μL、正反向引物各0.8 μL、ddH2O 6.9 μL。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40 個循環。設置3 次技術重復。以Actin為參比基因，使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。根據基因序列設計引物，引物序列見表1。

表1 定量PCR引物Table 1 Primer sequences used for q-PCR

1.4 數據處理與分析

采用Excel軟件進行數據統計，利用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 ABA處理對采后蘋果果實硬度和可滴定酸質量分數的影響

由圖1可知，隨貯藏時間延長，ABA處理組和對照組果實的硬度降低，可滴定酸質量分數先小幅增加后下降。貯藏末期，果實的硬度和可滴定酸質量分數均達到最低。貯藏前期ABA處理組和對照組的果實硬度和可滴定酸質量分數無顯著差異。ABA處理組果實硬度、可滴定酸質量分數分別于貯藏35、15 d后整體顯著低于對照組。

圖1 ABA處理后蘋果硬度（A）和可滴定酸質量分數（B）的變化Fig.1 Changes in fruit firmness (A) and titratable acid content (B) in ABA-treated apple fruit

2.2 ABA處理對采后蘋果果實PME和Cel活力的影響

由圖2可知，隨貯藏時間延長，ABA處理組和對照組樣品的PME活力不斷增加，Cel活力在貯藏中后期達到峰值后開始下降。與對照相比，ABA處理組的PME活力在貯藏25 d后迅速增加且顯著高于對照組（P＜0.05）。ABA處理組和對照組果實的Cel活力分別于貯藏第25、35天達到最高，且對照組Cel活力最高值低于ABA處理組；貯藏結束時兩組樣品Cel活力沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 ABA處理后蘋果果實PME（A）和Cel（B）活力的變化Fig.2 Changes in pectin methylesterase (A) and cellulase (B) activity in ABA-treated apple fruit

2.3 ABA處理對采后蘋果果皮葉綠素含量的影響

‘Granny Smith’蘋果果實采后成熟衰老過程中的顯著性特征是果實外觀色澤逐漸由綠色向黃色轉變。在此過程中，果皮中的葉綠素不斷降解。由圖3可知，對照組和ABA處理組果皮葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量均隨著貯藏時間的延長而逐漸降低。貯藏前期（0～15 d），對照組和處理組果皮葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均無顯著性差異。貯藏15 d后，ABA處理組果皮葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量開始低于對照組，且隨著貯藏時間的延長，兩組樣品間的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量差異增大，至貯藏末期差異達到最大。

圖3 ABA處理后蘋果果皮葉綠素含量的變化Fig.3 Changes in chlorophyll contents in ABA-treated apple fruit skin

2.4 ABA處理對采后蘋果果實內源ABA含量和乙烯產生速率的影響

由圖4A可知，ABA處理組和對照組的果實內源ABA含量變化趨勢一致。貯藏前期，兩組果實中內源ABA含量均迅速增加并達到峰值，之后隨著貯藏時間的延長而不斷降低。與對照組相比，ABA處理使內源ABA含量峰值出現的時間提前且峰值增大，ABA處理組和對照組內源ABA含量分別于貯藏的第10、15天達到峰值，峰值分別為61.05、42.71 ng/g。在貯藏的前25 d，ABA處理組內源ABA含量與對照組差異顯著，在貯藏后期（30 d后）與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

由圖4B可知，ABA處理和對照組蘋果乙烯產生速率的變化與內源ABA含量變化趨勢相近，呈整體上先升高后降低的趨勢。貯藏過程中，ABA處理組的乙烯產生速率整體上高于對照組。兩組蘋果乙烯產生速率均在貯藏10 d后開始急劇增加，ABA處理組和對照組乙烯產生速率分別在貯藏的第20、25天達到最高值，并且ABA處理組乙烯產生速率最高值（38.50 μL/（g·h））顯著高于對照組最高值（29.78 μL/（g·h））。

圖4 ABA處理后蘋果內源ABA含量（A）和乙烯產生速率（B）的變化Fig.4 Changes in endogenous ABA content (A) and ethylene production rate (B) in ABA-treated apple fruit

2.5 ABA對采后蘋果果實乙烯生物合成基因表達的影響

蘋果乙烯生物合成關鍵酶的編碼基因ACOs（ACO1和ACO2）和ACSs（ACS1和ACS3）定量結果明，ABA處理組和對照組蘋果采后貯藏期間，乙烯生物合成關鍵酶的編碼基因ACOs和ACSs的表達水平整體上均呈先增加后降低的趨勢（圖5）。兩組蘋果果實的ACOs和ACSs表達水平均在貯藏第20天時達到峰值，隨后開始下降。ABA處理組的ACOs表達水平在貯藏過程中均顯著高于對照組。相對的，兩組樣品中ACSs表達量在貯藏前期差異較小，與貯藏前期相比，在貯藏中期（15～30 d）兩組樣品的ACSs表達量均大幅增加，且ABA處理組的增加幅度更大。在貯藏中期的大多數時間，ABA處理組的ACSs表達量均顯著高于對照組。

圖5 ABA處理后蘋果乙烯合成相關基因表達量的變化Fig.5 Expression of genes involved in ethylene biosynthesis in ABA-treated apple fruit

2.6 ABA對采后蘋果果實乙烯信號轉導相關基因表達的影響

由圖6可知，隨著蘋果采后貯藏時間的延長，乙烯響應因子ERF3、ERF4、ERF5的表達量呈先升高后降低的趨勢，與蘋果采后成熟進程（乙烯產生速率）較一致。在貯藏過程的大多數時間里，ABA處理組的ERF3/4表達量顯著高于對照組。ABA處理組蘋果ERF5表達量在貯藏第20天和25天時明顯升高，且顯著高于對照組，在其他時期與對照組沒有顯著差異。整體上，乙烯信號轉導因子ERS2和ETR2隨著蘋果貯藏時間的延長表達量升高，在貯藏25天前后表達量達到最高，且ABA處理組高于對照組。在ABA處理組和對照組中，信號轉導因子ERS1的表達量變化沒有明顯的規律性，貯藏第10天和貯藏第25天時ABA處理組顯著高于對照組。

圖6 ABA處理后蘋果乙烯信號轉導相關基因表達量的變化Fig.6 Expression of genes involved in ethylene signal transduction in ABA-treated apple fruit

3 討 論

果實軟化主要是由細胞壁分解導致[19]。Giongo等[20]認為果實軟化過程中硬度的降低主要與總果交含量減少、初生細胞壁和中交層降解有關。細胞壁修飾酶PME的主要作用為催化果交去甲基化，生成多聚半乳糖醛酸酶作用底物[21]。Cel則主要在纖維素和木葡聚糖的β-1,4-葡聚糖骨架降解方面發揮作用[22]。這兩種酶在果實采后軟化過程中細胞壁降解方面起重要作用。本研究發現，ABA處理組果實PME活力在貯藏中后期（25～45 d）、Cel活力在貯藏前25 d均顯著高于對照組（圖2B）。較高的PME和Cel活力表明ABA處理組蘋果果實細胞壁降解反應較為活躍，導致ABA處理組果實硬度在貯藏期間快速下降且明顯低于對照組（圖1A）。類似的研究同樣發現ABA處理能夠明顯提高躍變型果實如香蕉[23]和芒果[8]果實軟化相關酶（PME、Cel和多聚半乳糖醛酸酶等）的活力，導致果實在采后貯藏期間硬度快速下降。

果實成熟過程中往往伴隨著色素類物質的降解與合成，果實呈現出色澤變化。葉綠素降解是果實成熟的明顯標志之一?！瓽ranny Smith’蘋果果實采后成熟過程中果皮中的葉綠素不斷降解，葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量不斷降低（圖3）。一系列的葉綠素分解代謝酶按順序催化葉綠素的降解[24-26]。研究表明ABA能夠調控葉綠素分解代謝酶編碼基因的表達，正向調控葉綠素的降解，并且該過程依賴ABA信號轉導途徑[27]。本研究發現，除能夠加速‘Granny Smith’果實軟化外，外源ABA處理還能顯著促進貯藏中后期果皮中葉綠素的降解，使果皮褪綠明顯。貯藏結束時，ABA處理組蘋果果皮的總葉綠素含量僅為對照組的73.46%。Lu Wenjing等[28]研究發現經ABA處理的香蕉果皮葉綠素含量在貯藏期間顯著下降，香蕉果皮色澤加速變黃。

乙烯對于呼吸躍變型果實的成熟至關重要。然而，果實成熟并不僅僅由單一激素調控，而是受到不同植物激素間復雜的反饋網絡共同作用[29]。乙烯和ABA可能在控制果實成熟方面具有同等重要的作用[30]。在呼吸躍變型和非呼吸躍變型果實中，ABA含量在果實成熟開始時會達到很高的水平[2-3,31]。本研究同樣發現在‘Granny Smith’蘋果采后貯藏早期，內源ABA含量迅速積累至較高水平，并且ABA處理組果實中內源ABA的積累速度和積累量明顯高于對照組。ABA處理組果實內源ABA含量在貯藏第10天達到峰值，是同時期對照組的2.32 倍；對照組內源ABA含量在貯藏第15天達到峰值，且較ABA處理組的峰值低30.04%。這表明外源ABA處理能夠顯著促進‘Granny Smith’蘋果果實內源ABA的積累，本研究結果與在番茄[7,32]和獼猴桃[33]等呼吸躍變型果實上開展的類似研究結果一致。有研究認為ABA作為上游調節因子啟動呼吸躍變型果實成熟可能是通過誘導乙烯合成而實現[4]。外源ABA可提高乙烯合成相關基因的轉錄水平，促進乙烯的生成，而使用ABA抑制劑則具有相反的作用[2,4,8,11,28]。類似地，本研究發現外源ABA處理顯著提高了蘋果ACO1、ACO2和ACS1、ACS3的表達水平，顯著促進了乙烯的積累。ABA處理組果實乙烯生成速率在貯藏第20天達到峰值，較同期對照組高54%；對照組乙烯生成速率在貯藏第25天達到峰值，且較ABA處理組的峰值低23%。這表明外源ABA處理能夠誘導‘Granny Smith’蘋果果實乙烯生物合成基因表達，促進乙烯生成。

植物乙烯受體（ETRs、ETRs和EIN4）作為乙烯響應途徑的負調節因子參與感知乙烯[34-35]。ERF被認為是乙烯信號轉導途徑中的最終響應基因，并與果實成熟相關基因（包括ACS、ACO）啟動子上的GCC-box結合，引起乙烯響應[36-37]。在蘋果采后成熟過程中，乙烯釋放量增加，乙烯受體基因（ETR2、ETR5、ERSs）和乙烯響應因子基因（ERFs）的表達量明顯上調。本研究結果與前人研究結果[38-39]一致。此外，與對照組相比，ABA處理還整體上顯著提高了乙烯信號轉導因子ERS2和ETR2以及乙烯響應因子ERF3/4/5的表達水平。這表明ABA處理促進了‘Granny Smith’蘋果采后貯藏期間的乙烯信號轉導。

綜上，與對照組相比，ABA處理能夠顯著增強采后‘Granny Smith’果實細胞壁降解酶（PME、Cel）活力，加速蘋果果實采后軟化進程，同時顯著降低果實貯藏中后期的可滴定酸質量分數，顯著促進蘋果果實內源ABA的合成，誘導蘋果乙烯生物合成基因和信號轉導基因的表達，促進蘋果內源乙烯合成和乙烯信號的轉導。