真菌毒素多重檢測技術研究進展

陳瑞鵬，孫云鳳，霍冰洋，秦英凱，李 雙，梁 俊，周煥英,*，高志賢,*

（1.軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050；2.天津科技大學 省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457）

真菌毒素是真菌在適宜條件下產生的一類小分子次級代謝產物，目前已知的真菌毒素約有400多種[1]。研究表明，大多數真菌毒素可抑制動物體內蛋白的合成，破壞細胞結構[2]，進而影響動物體肝臟[3]、腎臟[4]、神經[5]、造血等組織器官的正常運作[6]，具有強烈的致癌、致畸、致突變作用，對人和動物的生命與健康造成重大威脅[7]。據統計，全球每年約有四分之一的食物受到真菌毒素污染，其中2%的農產品因污染嚴重直接失去營養價值，造成嚴重的經濟損失[8]。常見的真菌毒素有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）B1、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（zearalenone，ZEN）、T-2毒素、伏馬毒素B1（fumonisin 1，FB1）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）和桔青霉素（citrinin，CIT）等[9-11]。

由于農產品作物生長、收獲、貯藏及運輸中都易受到產毒真菌的侵染，且所產生的真菌毒素在加工處理過程中不易被清除，因此，真菌毒素污染被認為是不可避免的污染問題[12]。更為重要的是，多重產毒真菌可能侵染同一農產品[13]，同時侵染的產毒真菌往往可以同時產生多種真菌毒素，因此在農產品中多種真菌毒素的共存成為一種不可忽視的必然現象，這就需要建立真菌毒素的多重檢測技術。本文綜述了近5 年真菌毒素多重檢測技術的研究進展，主要包括高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法、免疫層析法、化學比色法、電化學法、化學發光法、熒光法等，分析了這些方法在真菌毒素檢測中的應用與亟待解決的問題，并對其未來的發展應用前景進行了展望。

1 高效液相色譜-串聯質譜法

HPLC-MS/MS法集中了色譜的分離性能與質譜的分子確證優勢[14]，其在檢測器階段利用質量分析器對待測物進行二次選擇，將離子豐度轉換為可定量計算的峰，同時提供被測物的質量數與分子結構信息，具有穩定性好、靈敏度高、專一性強、再現性好等優點，已經成為分析檢測多組分真菌毒素的主要方法[15]。

樣品前處理是指對目標物進行提取、富集和凈化的步驟，以減少雜質干擾，提高檢測靈敏度。目前常采用的樣品前處理方法有一步提取法和分散固相萃取QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法。Zhao Hongxia等[16]利用HPLC-MS/MS法同時檢測植物油中的16 種真菌毒素，首先采用一步提取法對目標物進行提?。菏箻悠方涹w積分數85%乙腈溶劑提取和C18吸附劑處理，隨后將目標物在多反應檢測模式下的保留時間和離子對信息進行定量分析，該方法對16 種真菌毒素的加標回收率為72.8%～105.8%，檢出限為0.04～2.9 ng/mL。Bi Bo等[17]利用HPLC-MS/MS同時檢測人參樣品中11 種真菌毒素（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、CIT、FB1、FB2、HT-2毒素、T-2毒素、ZEN和OTA）。采用甲醇-水溶劑的一步提取法從人參中提取真菌毒素后直接分析測定，用基質匹配外標法對人參中的11 種真菌毒素進行定量，整個分析過程可在12 min內完成。該方法對11 種真菌毒素的檢測限和定量限分別為0.25～50 ng/mL和0.1～25 ng/mL。一步提取法可以有效簡化樣品前處理過程、減少目標成分的損失，但還同時存在一定的局限性。人參等復雜基質經一步提取后，基質中的其他復雜成分可能同時被共提取，會對質譜檢測器進樣口造成污染，影響檢測結果的準確性。Zhang Kai等[18]開發了穩定同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）同時檢測5 種食用油（菜籽油、玉米油、橄欖油、花生油和大豆油）中的12 種真菌毒素的方法。首先根據QuEChERS法將食用油中加入同位素內標，經乙腈-水（1∶1，V/V）超聲提取并離心去除油脂，所得溶液經濾膜過濾后用HPLC-MS/MS多反應監測方式檢測。該方法對12 種真菌毒素的加標回收率在80%～120%之間，檢測限在0.1～6.4 ng/mL之間。穩定同位素稀釋校正了前處理過程的損失和基質效應等因素對分析準確度的影響，但是它只能應用于不少于兩個穩定同位素的元素測定，使得測量元素的范圍受到限制，同時同位素稀釋劑的制備成本較高，試劑獲取困難，需要研發各種新型的同位素稀釋劑使得穩定同位素稀釋-LC-MS/MS在真菌毒素檢測領域得到更廣泛的應用。表1總結了近5 年LC-MS/MS法在不同食品中多重真菌毒素檢測中的應用。

表1 LC-MS/MS法在多重真菌毒素檢測中的應用Table 1 Applications of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the detection of multiple mycotoxins

近5 年來在真菌毒素多重檢測方面LC-MS/MS法極大程度降低了基體的干擾，檢測靈敏度和準確度得到了極大的改善，但檢測成本仍然較高。開發快速、低成本、操作檢測的檢測技術，并實現應用于現場檢測多重真菌毒素的方法，是未來LC-MS/MS法的研究熱點。

2 免疫層析法

免疫層析法是指將識別元件（抗原）和采用交體金[25]、磁珠[26]、熒光微球[27]等標記的捕獲元件（抗體）固定在硝酸纖維素膜上，標記物作為信號指示物的檢測方法。在分析時，待測液溶解標記的抗體在毛細管作用下沿著試紙條遷移，結合區域產生顏色、熒光等信號變化定性或定量分析多組分真菌毒素。免疫層析法根據目標物的大小分為雙抗夾心法和競爭法，其中真菌毒素是單一抗原表位的小分子物質，適用于競爭免疫分析法[28]。

量子點是元素周期表中IIB族和VIA族元素組成的一類半導體材料（如CdTe、CdSe、ZnS等）或元素周期表IIIA族和VA族元素組成的一類半導體材料（如InAs、InP、InGaAs等）組成的納米顆粒，具有激發光譜寬、發射光譜窄且重疊小等優點，當單一光源激發時，不同量子點所發出的熒光不同，因此可以應用于真菌毒素的多重檢測。Shao Yanna等[29]建立了基于量子點熒光微球（quantum dot beads，QBs）同時檢測AFB1、FB1和OTA的免疫層析試紙條法。利用生物素和鏈霉親和素（biotinstreptavidin，biotin-SA）之間的高親和力以及多級信號放大效應，顯著提高免疫層析法的靈敏度。該方法以牛血清白蛋白偶聯生物素為控制線，以QBs-SA作為控制線探針的獨立控制線信號體系，并與常規羊抗鼠IgG抗體的控制線體系進行了性能對比。以biotin-SA作為多目標物定量檢測的對照信號，不受目標物真菌毒素的干擾，優于羊抗鼠IgG抗體，提高了檢測的準確性和穩定性。對AFB1、FB1、OTA的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為46.94、10.31、0.44 pg/mL。

納米金粒子因其制備簡單、價格低廉、性質穩定等優點，在真菌毒素的多重檢測中得到了廣泛應用。Huang Xinyu等[30]采用花狀納米金粒子作為免疫標記探針，研發了可同時檢測中藥中DON和FB1的免疫層析試紙條?；罴{米金比表面積大有利于提高試紙條的檢測靈敏度，該方法對DON和FB1的檢測限均為5 ng/mL且檢測時間僅需5 min，與球型納米金作為免疫標記物的試紙條相比，靈敏度提高了4 倍。

時間分辨免疫層析技術（time-resolved fluorescent immunochromatographic assay，TRICA）結合時間分辨熒光免疫分析和層析技術，借助高靈敏的標記示蹤物，用于微量檢測毒素[31]。示蹤物多由兩種不同的鑭系元素離子（分別作為光吸收子和發射子）及陶瓷顆粒（作為主基質）摻雜構成[32]，靈敏度高和穩定性高，優于常用的標記物。Tang Xiaoqian等[33]研發了基于TRICA同時檢測AFB1和ZEN的新方法。首先合成了具有熒光增強效果的銪/鋱納米球作為示蹤物，并分別和抗獨特型納米抗體（anti-idiotypic nanobody，Aldnb）和單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）偶聯，構建了兩種基于競爭法的時間分辨熒光免疫試紙條（Aidnb-TRFICA和mAb-TRFICA）。Aidnb-TRFICA對AFB1和ZEN的IC50分別為0.46 ng/mL和0.86 ng/mL，比mAb-TRFICA對AFB1和ZEN的IC50分別提高了18.3、20.3 倍，Aidnb-TRFICA對AFB1和ZEN的檢測限分別為0.05、0.07 ng/mL。

近5 年免疫層析法的靈敏度和準確度得到了改善，但其中熒光物質的穩定性差是該技術發展的瓶頸。一方面可以利用有機材料將數以萬計的熒光物質包裹成納米微球，增加熒光物質的穩定性，減少非特異性吸附，提高熒光信號強度；另一方面可以研發新材料，例如使用近紅外的熒光材料等，最大限度地避免背景熒光物質的干擾。免疫層析法中的硝化纖維膜試紙條的組成結構復雜，制備時易出現不均勻現象，同時可能會存在非特異性吸附反應，會使溶液層析時液面不均勻，使檢測結果產生誤差。將免疫層析法構建于微流控芯片平臺上，研究微流控芯片中表面的抗原抗體修飾以及固定技術，制成微流控免疫層析芯片，可以極大提高檢測的靈敏度和重復性，是免疫層析法在未來的研究熱點。

3 化學比色法

化學比色法是指利用待測物與化學試劑之間發生明顯的化學顯色反應，通過與標準品比較顏色或在一定波長處比較吸光度，從而對待測物進行定量檢測的方法[34]?；瘜W比色法中的顯色反應通常具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物性質穩定，顏色差異明顯[35]。具有成本低廉、操作簡單、檢測迅速、結果直觀等優點，已經廣泛應用于真菌毒素的多重快速檢測中。

Zhu Weiran等[36]構建了氧化石墨烯同時比色檢測OTA和AFB1的磁控雙方法。該方法基于金納米顆粒的類酶活性，其在酸性條件下可催化3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺顯色以及pH值敏感的變色染料分子百里酚酞在堿性條件下顯色，通過DNA耦合以及DNA自組裝，磁分離固體在堿性條件下釋放百里酚酞分子實現AFB1的可視化檢測，上清液在酸性條件下催化TMB實現對OTA的可視化檢測。該方法對AFB1和OTA的檢測范圍分別為5～250 ng/mL和0.5～80 ng/mL。Sheini等[37]開發了基于金銀納米顆粒的聚集比色法用于同時檢測AFB1、OTA和ZEN。首先使用3 種不同的還原劑（多巴胺、咖啡酸和聚乙烯吡咯烷酮）合成3 種不同類型的金銀納米顆粒，然后將金銀納米顆粒注入疏水性基底的親水性圓形區域，加入真菌毒素后，金銀納米粒子發生聚集反應，金銀納米粒子分別變化為紫色和棕色，根據金銀納米粒子顏色的變化對3 種真菌毒素進行痕量分析。該方法對AFB1、OTA和ZEN的檢測限分別為2.7、3.3 ng/mL和7.0 ng/mL。

在近5 年內，化學比色法基于金納米粒子獨特的光學性質開發的多重檢測真菌毒素在選擇性、靈敏度、快速性和便攜性等方面有了顯著改善，但還存在一些需要解決的問題：由于對待測物自身的化學性質依賴性較強，在檢測過程中易受到外部環境的干擾，影響檢測結果的準確性。該問題可以通過提高金納米粒子的穩定性，基于其表面等離子體對應光譜偏移的顏色變化進行檢測，增加檢測方法準確性；使金納米粒子信號可控放大，對真菌毒素進行更準確的定量分析。

4 電化學法

電化學法是根據電解質溶液中物質的電化學性質及其變化規律，建立在電學量（電流、電位、電陰或電量）與待測目標物之間的計量關系的基礎上，對目標物進行定性或定量分析的方法。具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、易于自動化、操作簡便等優點，在真菌毒素的多重檢測中有著廣泛的應用。

Aori Qileng等[38]開發了基于光電化學（photoelectrochemistry，PEC）和方波伏安（square wave voltammetry，SWV）法的比率雙信號傳感器同時檢測OTA、OTB和OTC的方法。首先在導電玻璃表面修飾二硫化鉬（MoS2）納米片，然后用化學沉積法在電極上固定CdS，加入抗原孵育，隨后加入OTA與mAb進行免疫競爭反應，反應結束后加入ZnS/Ag2S＠Aldnb，形成免疫復合物MoS2NFs/CdS-Ag-mAb-ZnS/Ag2S＠Aldnb，在免疫識別過程中，ZnS/Ag2S標記的沉積會影響MoS2NFs/CdS的PEC電流與ZnS溶解Zn2+的SWV電流，以ZnS/Ag2S納米籠為標記，產生PEC響應和SWV響應的比值信號。該傳感器對OTA、OTB和OTC的檢測限分別為0.1、0.5、0.5 ng/mL。Han Zheng等[39]構建了以還原性MoS2-Au為基底材料，核酸適配體為電化學分子識別元件，選用硫堇和二茂鐵基己硫醇作為電化學信號指示劑用于同時檢測玉米中的ZEN和FB1。其中以還原性MoS2-Au作為基底材料，不僅可以放大信號，促進電子的傳遞速率，更有利于核酸適配體的固定。該方法對ZEN和FB1的檢測范圍分別為1 pg/mL～100 ng/mL和1 pg/mL～10 ng/mL，檢測限均為0.5 pg/mL。Wang Chengquan等[40]將兩種金屬元素的量子點包覆在SiO2微球表面，以金殼包覆的磁性納米粒子為載體，基于核酸適配體與互補鏈組裝納米復合材料作為生物探針，以核酸適配體為識別元件同時檢測OTA和FB1的電化學磁控適配體傳感器，該方法對OTA和FB1的檢測限分別為5 pg/mL和20 pg/mL。

近5 年電化學法在多重檢測真菌毒素的靈敏度和特異性方面得到了極大的提高。但是目前仍然存在一些急需解決的問題：1）樣品前處理的過程比較費時費力，需要進一步簡化樣品的前處理流程；2）電化學傳感器的分子識別元件的穩定性、使用壽命以及非特異性結合能力有待進一步提高；3）電化學信號指示劑的種類有限，需要研發更多的電化學信號指示劑。

5 化學發光法

化學發光是指由化學反應引起的發光現象?；瘜W發光法是指利用化學發光反應，對化學發光物質由激發態躍遷回基態時發出的光信號進行檢測分析的方法[41]。該方法在檢測過程中不需要外加光源，可以避免其他光源產生的干擾以及帶來的其他誤差，具有操作簡便、易于實現自動化和分析速度快等分析檢測的優點，已廣泛運用于真菌毒素的多重檢測分析中。

Xu Jie等[42]建立了基于水凝交光子晶體微球的化學發光法同時檢測農產品中的FB1、AFB1和OTA。首先利用3 種水凝交微球分別包被3 種真菌毒素對應的抗原，然后將3 種水凝交光子晶體微球同時加入3 種真菌毒素，使其發生特異性結合反應，用光纖光譜儀對水凝交光子晶體微球進行解碼，最后分別檢測3 種水凝交光子晶體微球的魯米諾-H2O2化學發光體系的化學發光信號，從而實現3 種真菌毒素的多重檢測。該方法對FB1、AFB1和OTA的檢測限分別為2.1、1.7 pg/mL和0.4 pg/mL。Jiang Fan等[43]開發了基于表面等離子體耦合同時檢測CIT、AFB1和OTA的化學發光法。首先將銀納米顆粒和真菌毒素對應的抗原依次固定在氨基化的玻璃芯片上，其中銀納米顆粒的局域表面等離子體激元共振效應能增強芯片上的化學發光，通過抗原、抗體和真菌毒素小分子的競爭免疫反應來實現真菌毒素的多重檢測。該方法對CIT、AFB1和OTA的檢測限分別為0.39、0.44 pg/mL和0.83 pg/mL。Li Li等[44]開發了基于96 孔板的同時檢測大麥中的DON、ZEN、T-2毒素和FB1化學發光免疫法。首先采用紫外光引發聚合反應的方法，用紫外光光源激發光引發劑光解產生自由基引發丙烯酸酯類單體聚合制備單孔陣列，然后將4 種真菌毒素對應的抗體固定在96 孔板上形成區域陣列，基于化學發光免疫反應同時檢測大麥中的4 種真菌毒素。該方法對DON、ZEN、T-2毒素和FB1的檢測限分別為3.6、4.8、3.9、1.7 pg/mL。

目前在實際應用中化學發光法仍然存在幾個問題：1）化學發光劑和增強劑種類較少，急需研發更多的化學發光劑和增強劑來拓展化學發光法的應用范圍；2）發展化學發光法和傳感技術、毛細管電泳技術等聯用，擴大化學發光法在真菌毒素檢測分析中的應用；3）研發化學發光法儀器設備的小型、便攜式、自動化和一體化，有助于推進化學發光儀器的商業化。

6 熒光法

熒光法是利用待檢測物經外加頻率的紫外線照射后，激發出能夠反映其特性的熒光，通過微孔板熒光儀[45]、熒光顯微鏡[46]、激光共聚焦顯微鏡[47]和熒光分光光度計[48]等儀器檢測熒光強度，從而實現對待檢測的定量分析。熒光分子可以在很短的時間內被大量反復的激發和監測，量子產率較高，具有靈敏度高、選擇性強和定量精準等優點，已廣泛應用于真菌毒素多重檢測中。

Liu Rui等[49]開發了基于TiO2多孔硅（porous silicon，Psi）表面適配體同時檢測OTA、AFB1和FB1的微陣列熒光法。Psi表面的TiO2納米層比熱氧化Psi的熒光強度增強了14 倍，通過分別用熒光染料和淬滅劑標記真菌毒素適配體和抗適配體的雜交雙鏈體DNA對TiO2-Psi表面進行適配體熒光信號恢復的原理，達到同時檢測真菌毒素的目的。該方法對OTA、AFB1和FB1的檢測限分別為15.4、1.48 pg/mL和0.21 pg/mL。Zhang Dagan等[50]開發了基于硫黃素T（thioflavin T，ThT）/G四鏈體超分子結構為光學標簽的交體晶體條形碼同時檢測AFB1、FB1和OTA的方法。首先將探針通過共價鍵偶聯在光子晶體（photonic crytal，phC）顆粒上，形成一個分子信標（molecular beacon，MB）結構，其中包含真菌毒素適配體和G-四鏈體序列。當沒有靶標物時，G-四鏈體形成序列被鎖定在MB的發卡結構中，因此沒有熒光信號。將靶標物加入MB修飾的phC顆粒中，MB的發卡結構基于靶標物和適配體的特異性識別而打開，導致G-四鏈體區域暴露，大量的ThT結合在phC顆粒表面的G-四鏈體結構上，從而導致強烈的熒光信號，靶標物濃度與phC條形碼的熒光強度成正比。該方法對3 種真菌毒素的檢測范圍為1.0 pg/mL～100 ng/mL，檢測限為0.7 pg/mL。Zhang Jing等[51]研發了一種基于DNA支架銀納米簇（silver nanocluster，AgNCs）和Zn2+離子信號增強的熒光適配體傳感器同時檢測OTA和AFB1的方法。首先將OTA適配體（aptamer，Ap）1和AFB1Ap2通過生物素-鏈霉親和素固定在磁珠表面，單鏈（signal probe，Sp）1和Sp2分別與OTA和AFB1的適配體雜交形成Ap1-Sp1、Ap2-Sp2復合物。當存在靶標物OTA和AFB1時，靶標與各自對應的適配體結合形成OTA-Ap1、AFB1-Ap2復合物，Sp1和Sp2被釋放至溶液中，經磁分離，Sp1和Sp2分布在上清液中作為合成DNA/AgNCs的支架，上清液中Sp1/AgNCs、Sp2/AgNCs的熒光信號強度分別與OTA和AFB1的濃度呈正相關。其中Zn2+離子的引入可以使熒光信號顯著增強。該方法對OTA和AFB1的檢測限分別為0.2 pg/mL和0.3 pg/mL。

近5 年熒光法多重真菌毒素的檢測時間縮短且靈敏度得到極大改善，但是大多數常用的熒光團的熒光壽命以秒為單位，并且需要特定的儲存條件來穩定其熒光響應，目前熒光法還未應用于多重真菌毒素的現場檢測分析中。目前熒光分析法主要呈現以下幾個趨勢：1）針對自身無熒光物質，研發反應活性高、量子產量大的熒光探針，從而拓寬檢測的領域；2）針對不同基質及目標化合物，探索最佳提取方式以及凈化手段，實現最佳回收率及特異性；3）將熒光分析技術與光學、電化學等多方面技術結合，構造成集成便攜式的綜合檢測體系，實現實時同步獲得檢測和分析的信息。

7 拉曼光譜法

拉曼光譜是光穿過透明介質時由于分子的非彈性散射使光頻率發生變化而產生的一種散射光譜。拉曼效應是光子與光學及聲子相互作用的結果，拉曼散射光譜可以獲取分子振動能級與轉動能級躍遷的特征信息，具有強大的分子識別能力，是分子信息快速獲取的理想手段。但常規拉曼散射強度比較弱，靈敏度不高。表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）極大地克服了常規拉曼光譜靈敏度不高的不足同時又保留了拉曼光譜的實時、快速的特點，已被廣泛應用于真菌毒素多重檢測中。

SERS具有靈敏度高和多分子無標記等優勢，雙金屬等離子的核和殼組成的拉曼編碼粒子表現出獨特的局部表面等離子體共振效應，和其他納米粒子相比，銀離子具有最好的等離子增強效應，而金離子良好的生物相容性可以作為銀殼的外部殼層以防止銀的氧化和毒性，同時可以提高納米粒子的整體穩定性[52]。Zhao Yuan等[53]開發了基于拉曼信標分子編碼銀＠金核殼納米粒子同時檢測OTA和AFB1。首先在拉曼信標分子編碼的銀＠金納米粒子分別修飾靶標物對應的適配體，在磁性納米粒子上修飾靶標物對應適配體的互補鏈，通過適配體與互補鏈的雜交互補配對原則，拉曼信標分子編碼銀＠金核殼納米粒子組裝在磁性納米粒子周圍，該結構表現出較強的拉曼信號。當加入靶標物后，靶標物和適配體特異性識別，使得對應的拉曼分子編碼銀＠金核殼納米粒子從磁性納米粒子表面脫落，經過磁分離，組裝體的拉曼信號減弱，拉曼信號與靶標物的濃度呈負相關，從而實現真菌毒素的同時定量檢測。該方法對OTA和AFB1的檢測限分別為6 pg/mL和30 pg/mL。Li Yu等[54]開發了一種基于SERS技術同時檢測AFB1、ZEN、OTA的免疫傳感器。首先在金納米顆粒上修飾拉曼信號分子5,5-二硫代雙(琥珀酰亞氨基-2-硝基苯甲酸)并與真菌毒素的抗體共價偶聯作為SERS的納米探針。而AFB1抗原、ZEN抗原、OTA抗原共價偶聯在微陣列金芯片表面作為捕獲探針。這種傳感器對AFB1的檢測范圍為0.061～0.066μg/kg，ZEN的檢測范圍為0.53～0.57 μg/kg，OTA的檢測范圍為0.26～0.29 μg/kg。

拉曼光譜作為一種新興技術近年來在多重真菌毒素檢測方面顯著降低了檢測成本、提高了檢測的靈敏度和特異性，但目前SERS技術的發展與應用仍存在許多問題亟待解決：1）SERS信號的增強機理不清晰，相比實驗和應用方面取得的進展，理論研究相對滯后；需要科研人員加強SERS在增強機理方面的研究；2）性能較好的SERS基底材料均為貴金屬與其他材料的復合物，成本高；3）SERS基底的復現性差，檢測方法難以商業化和標準化；4）SERS技術尚未建立多種真菌毒素的“拉曼光譜指紋”數據庫，對于未建立指紋圖譜的真菌毒素較難檢測，需要進一步完善“拉曼光譜指紋”數據庫。

8 其 他

目前也有一些其他技術廣泛應用于真菌毒素的多重檢測中。已知傳統真菌毒素檢測方法與智能手機的結合是達到便攜化的一個良好手段，因此，基于智能手機圖像處理的平臺，尋找一種配套檢測與編碼的載體，使其編碼信號清晰、可變、容量高、檢測信號靈敏具有重要的現實應用意義。Ji Wanying等[55]開發了基于水凝交形狀編碼與圖像處理解碼的方法同時檢測OTA和AFB1。首先利用微流控平臺與停止流動光刻技術制備偶聯真菌毒素適配體的水凝交微粒，依據編碼及圖像處理解碼技術對水凝交顆粒熒光圖像進行獲取，通過智能手機上圖像識別程序對熒光圖像進行分析。該方法對AFB1和OTA的檢測范圍分別為0.1～200 ng/mL和0.1～500 ng/mL，檢測限均為0.1 ng/mL。Yang Minye等[56]研發基于上轉換納米顆粒和熒光圖像處理的智能手機相結合用于真菌毒素的多重檢測。首先合成直徑為2～8 μm的上轉換磁性編碼微球，通過980 nm的近紅外光照射，不同上轉換粒子編碼微球可發出不同顏色的可見光，每種顏色代表一種待測物，通過智能手機自編的應用程序對編碼微球的圖像進行分析，可在1 min之內得到檢測結果，該方法對ZEN、OTA和AFB1的檢測限分別為0.05、0.1 ng/mL和0.1 ng/mL。

9 結 語

本文重點介紹了近5 年真菌毒素多重檢測技術的研究進展，主要檢測方法有HPLC-MS/MS法、免疫層析法、化學比色法、電化學法、化學發光法、熒光法等，分析比較了這些方法在真菌毒素多重檢測中的優缺點。

當前多重真菌毒素檢測的研究多是通過樣品前處理將毒素分子從待測物質中提取凈化，合成或利用新的納米材料，如金納米粒子、量子點、修飾抗體等免疫標記示蹤物的納米微粒等，利用其在不同檢測方法中優良的光學特性，構建可與待測物特異性識別的檢測體系，實現樣品中毒素分子的定量檢測。目前多重真菌毒素檢測的研究重點主要集中在以下幾個方面。1）樣品提取。樣品前處理多采用一步提取法或QuEChERS法，隨著提取方法的不斷使用、改良和驗證，現已建立起針對不同樣品良好的凈化體系，為之后待測物質的檢測提供了良好的檢測環境。2）納米材料。隨著科研人員長期不懈努力，納米材料領域不斷延伸發展，目前有越來越多的新型材料被應用于多重真菌毒素檢測，其光學性能穩定可靠，研究人員可根據自身需要及客觀環境選擇合適的納米材料構建檢測體系，利用化學比色法、化學發光法、熒光法等實現對毒素的多重準確檢測。研究出更多化學性質穩定、易于合成、體積均一、成本低廉的納米材料依然是今后研究的重點。3）識別原件。對待測物質的靈敏識別是制約檢測體系靈敏度、準確性與特異性的關鍵。當前研究多是通過識別原件與真菌毒素分子之間基于分子結構或抗原抗體特異性結合的免疫學特性對待測物質進行識別。檢測體系中出現的識別原件的非特異性吸附、分子穩定性差、識別物使用壽命短、不可重復使用等問題嚴重制約了多重真菌毒素檢測的發展，解決信號分子與真菌毒素之間的特異性識別是該研究的難點。4）檢測方法。隨著各種新技術的不斷發展，現已出現了諸如與微流控技術結合、與智能手機相結合、拉曼光譜等各種新型檢測技術。與微流控技術結合，可極大提高檢測的靈敏度和重復性。與智能手機相結合可實現樣品的快速、準確檢測，同時可用于現場實地檢測。拉曼光譜作為一種新興檢測技術，通過對真菌毒素“指紋圖譜”進行檢測，能夠顯著降低檢測成本，且儀器便攜，可實現毒素的實時精確定量。但作為新興檢測技術，以上方法仍存在各種不足，實現檢測方法的快速、低廉、便攜、靈敏、精確檢測依然需要研究人員繼續探索，不斷完善。

面對不可避免的真菌毒素污染問題，未來應更加重視食品生產運輸過程中真菌毒素污染累積的關鍵點，把握源頭和過程控制，建立環保、綠色、安全的真菌毒素全程管控技術規范。在真菌毒素多重檢測方面，要加強真菌毒素多重檢測的現場實地應用開發，研發快速檢測裝備和小型便攜式的商業設備是農產品真菌毒素多重檢測中的兩個熱點發展趨勢。