食源性致病菌污染估計中刪失數據分析的研究進展

孫天妹，劉陽泰，王 翔，董曉璐，劉 弘，李紅梅，董慶利,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市疾病預防控制中心，上海 200336）

食品安全已成為國際性公共衛生問題，根據世界衛生組織2019年的報告，全球每年至少有6億 人患食源性疾病，由此引發的死亡人數高達42 萬，所致疾病負擔累計為3 300萬 人年[1]。2017年全國各省份通過國家突發公共衛生事件報告管理信息系統報告的食物中毒事件的統計結果表明，細菌性食物中毒事件的報告數量和中毒人數最多，分別占食物中毒事件總數和中毒總人數的31.61%（110/348）和57.60%（4 256/7 389），所涉及的食源性細菌主要有沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱“單增李斯特菌”）和致瀉性大腸桿菌等[2]。因此，對食品中的致病菌進行風險評估對保障食品安全、降低食源性疾病暴發率具有重要意義。

微生物定量風險評估（quantitative microbial risk assessment，QMRA）作為有效工具之一，通過量化的數值描述致病菌對人群健康產生不良作用的風險，為監管者提供科學的風險管理依據[3]。QMRA分為危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述4 個模塊[4]，其中包含大量的不確定性因素，可能影響最終評估結果的準確性。暴露評估作為風險評估的核心內容，主要依據目標致病菌在目標食品中的污染量，結合居民食品消費量，估計致病菌暴露于消費者的可能性水平[5-6]。因此，食品中致病菌的污染量信息是定量風險評估中不確定性的重要構成因素之一[7]。

致病菌在食品中的污染情況主要依靠食品采樣和微生物學檢驗獲悉。最大可能數法和平板計數法是微生物定量檢測中較常用的兩種方法[8]。除此之外，熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）、變性梯度凝交電泳和宏基因組測序等分子生物學技術作為快速檢測方法，在致病菌的定量檢測中也得到了初步應用[9]。在實際情況中，由于檢測方法的限制，當致病菌污染水平低于或高于相對應的檢測閾值時，因無法完全定量食品中存在的致病菌而產生大量刪失數據（censored data），造成食源性致病菌污染檢測信息的不完整。在對食源性致病菌的污染檢測數據進行濃度估計時，若不考慮刪失數據的存在，其結果往往會產生較大的偏差，提升風險評估結果的不確定性。與此同時，致病菌在食品中的污染水平較低，其檢測數據具有一定的變異性。因此，有效處理致病菌污染檢測中出現的刪失數據有利于保證食源性致病菌污染水平估計的精準化，提高風險評估結果的準確性。

近年來，刪失數據分析主要用于應對臨床醫學、生命科學及環境科學等領域的生存類數據，而在食源性致病菌污染水平估計方面尚無完整的刪失數據分析體系，缺乏不同處理方法對估計結果影響的認知。故本文圍繞食源性致病菌污染檢測數據中刪失數據的類別、常用分析方法以及不同刪失數據情況下污染水平估計的精準化展開綜述和討論，以期為風險評估人員和風險管理人員提供理論參考，進一步加強食品安全的風險控制。

1 食源性致病菌污染檢測中刪失數據的分類

食源性致病菌污染檢測的結果一般以不可檢測（non-detect，ND）、陽性或某一分析單元中的濃度表示，其中ND值即為刪失數據。統計學上將刪失數據定義為“未量化的觀測值”，易對統計數據的整體描述產生干擾。在食品微生物學領域，根據食源性致病菌的檢測特點，將其刪失數據主要分為以下3大類：左刪失數據（left-censored data）、右刪失數據（right-censored data）以及區間刪失數據（interval-censored data）[10]。

1.1 左刪失數據

食源性致病菌的定性檢測和定量檢測方法均有定性檢測限（limit of detection，LOD）或定量檢測限（limit of quantification，LOQ）。當檢測樣品中致病菌的濃度過低，低于所用檢測方法的LOD或LOQ時，此類ND值為左刪失數據[11]。對左刪失數據進行處理分析，可降低部分樣品中存在致病菌污染而檢測結果為陰性的數據對食源性致病菌整體濃度估計產生的偏差。

1.2 右刪失數據

食源性致病菌定量檢測方法除了存在一個較低的LOQ外，往往還有一個最大的檢測限值與之相對應。當檢測樣品中的致病菌濃度過高，超出該檢測方法的最大檢測閾值時，通常會以多不可數的結果進行報告，此類ND值為右刪失數據[12]。致病菌在食品中的污染水平較低，因此在實際檢測中，出現右刪失數據的情況較少。

1.3 區間刪失數據

在食源性致病菌檢測中，同一樣品可能會經多種方法進行檢測與鑒定。由于檢測方法的不同，其檢測限、敏感性和特異性也有所不同[13]，因此樣品在檢測過程中往往會出現在某一檢測方法下不可檢測，而在另一檢測方法下產生陽性數據的現象。如某一樣品同時進行定性檢測和定量檢測，該樣品在定性檢測時結果為陽性，在定量檢測時結果呈現ND值（即陰性）。在食源性致病菌的污染檢測中，具有此類特征的數據被稱為區間刪失數據[14]。對區間刪失數據進行有效地統計分析可避免因檢測方法的差異而產生的假陽性或假陰性數據對食品中致病菌濃度水平的低估或高估。

2 食源性致病菌污染檢測中刪失數據的分析方法

在食源性致病菌的污染檢測數據中，刪失部分無法提供準確的檢測濃度。通過選擇適當的統計學方法來分析刪失數據，可從包含ND值的污染檢測數據中提取最大數量的可靠信息，從而提高食源性致病菌污染濃度估計的準確性。圖1整理了醫學、生命科學及環境科學等領域用于刪失數據處理分析的相關統計學方法，主要包括替代法、多重填補（multiple imputation，MI）法、參數估計法、非參數估計法、假設檢驗比較法及回歸分析法這6大類，其中一些方法可引入食源性致病菌污染檢測刪失數據的分析中[15-17]。根據文獻調研，較常用于食源性致病菌污染檢測刪失數據定量估計的方法主要有替代法、參數估計法、非參數估計法和MI法，表1對這4 類常用分析方法的特點和局限性進行了逐一比較。由于假設檢驗比較法多用于比較可檢測值的數據集和包含ND值數據集之間的差異顯著性，而回歸分析法需滿足數據的獨立性假設，在處理具有相互依賴關系的數據集時具有一定難度，故這兩種方法在食源性致病菌的污染水平估計中使用頻率較低。

圖1 刪失數據分析的主要方法Fig.1 Methods commonly used for censored data analysis

表1 食源性致病菌刪失數據分析中4 類常用方法的特點和局限性比較Table 1 Comparison of the advantages and disadvantages of four commonly used methods for the analysis of foodborne pathogens censored data

2.1 替代法

早期研究通過借鑒分析化學檢測中ND值的處理，在食品微生物學中采用刪除法來處理檢測中出現的ND值，即在分析過程中將ND值去除，只保留可檢測值用于分析。由于食源性致病菌污染水平對ND值較為敏感，通過該方法估計的結果可能存在較大偏差，故該方法不適宜用于處理食源性致病菌的污染檢測刪失數據。由此，在隨后的食源性致病菌污染檢測數據分析中采用替代法來處理ND值，較為常見的是將ND值作“0”值處理。然而，檢測中ND值的產生，一方面可能由于檢測樣品未受微生物污染，為真實的“0”值；另一方面可能由于樣品中存在目標致病菌，因受方法限制而未成功檢出[22]。由于后一種情況的存在，將ND值作“0”值處理并不恰當。Shoari等[18]通過蒙特卡洛方法模擬環境樣中的污染數據，將低于LOD的ND值用LOD的不同形式（如LOD、LOD/2或LOD/等常數）來替代，結果表明替代法的性能隨數據集中刪失比例的降低而提高。由于替代法是用單一值替代數據集中所有的ND值，因此當ND值在整個數據集中占比較大時，使用該方法會使食源性致病菌整體的濃度估計產生較大偏差[23-24]。

2.2 參數估計法

參數估計法需要對數據進行特定的分布假設，主要分為最優分布擬合法、MLE法和ROS法[19]。最優分布擬合法是運用合理的統計分布模型來描述食品中致病菌的頻率分布，從而可近似估計致病菌的污染水平[25]。國際生命科學協會在已發表的理論研究中提出，在選擇恰當的統計分布模型時可根據以下5 個特征，分別是非負、允許“0”值、離散型、可遞減（或近似）泊松分布以及致病菌數量較高時，應近似對數正態分布[26]。表2列舉了不同種類的統計分布模型分別具備的特征以及描述致病菌在不同食品基質中污染情況的應用。

表2 不同種類的統計分布模型所具備的特征以及描述致病菌在食品基質中污染情況的應用Table 2 Characteristics of different types of statistical distribution models and their applications for describing the contamination of pathogens in food matrix

當食源性致病菌污染檢測數據中ND值比例較小時，可選取恰當的標準統計分布模型進行近似擬合。若食源性致病菌污染檢測數據中存在大量刪失數據，導致數據集呈零膨脹（zero-inflated）現象時，零膨脹模型更適宜。Kiermeier等[33]發現零膨脹泊松分布可很好地擬合牛肉中大腸桿菌O157的檢測數據。孫菀霞等[35]在散裝熟肉制品單增李斯特菌左刪失數據的處理分析中發現，零膨脹對數正態分布與零膨脹泊松對數正態分布的擬合度優于標準統計分布。然而，在運用零膨脹模型時，若對模型本身產生的“0”值和致病菌檢測中產生的“0”值處理不當，可使擬合得到的致病菌濃度產生偏差[36]。

MLE法是假定數據集中的刪失部分和未刪失部分都遵循相同的分布（如對數正態分布等），再通過似然函數進行參數估計，使數據與假定的分布實現較高程度的吻合。當數據特征接近于假定的分布且模型擬合良好時，使用MLE法可有效處理刪失數據。而ROS法是僅對數據集中的未刪失部分進行某一特定的分布假設，建立次序統計量回歸方程，并對刪失數據進行填補[37]。MLE法和ROS法在應用中也存在一定的缺陷性，如這兩種方法易受到異常值的影響，且對假定的分布選擇較為敏感。由于研究者們習慣假定數據服從于對數正態分布，因此在估算平均值和標準差時易產生反向轉換偏差。為了解決這些問題，Kroll[38]和Helsel[39]等分別提出了穩健MLE法和穩健次序統計量回歸法，從而可以較好地避免數據轉換中平均值和標準差的異常估計。部分研究者認為MLE法是處理刪失數據的“黃金標準”，當數據集中包含至少30～50 個可觀測值時，MLE法具有最佳性能；而當數據集高度偏斜且刪失程度較高時，MLE法可能并不適用[40]。加拿大衛生部在《關于復雜人類健康的詳細化學定量風險評估指南》中建議，MLE法適用于大樣本量的數據處理，而ROS法適用于一般樣本量的數據處理[41]。

2.3 非參數估計法

由于刪失數據的存在，研究人員常常無法得到足夠多的信息來判斷數據資料服從何種分布假設。非參數估計法無需計算參數，也無需假定數據的分布，不受樣本數據從屬總體分布的限制，因此在刪失數據處理分析中應用較多[20]。KM法作為一種非參數法，基于一個累積分布函數，對包含隨機刪失數據的觀測值直接估計累積概率。KM法最初用于右刪失數據的處理，后經Turnbull[42]推廣到左刪失數據分布函數的非參數擬合中，即形成Turnbull估計法。Helsel[43]在分析處理環境水樣檢測中毒性當量濃度的左刪失數據時比較了替代法和KM法，結果表明使用KM法進行濃度估計效果要優于替代法，且KM法適用于數據精度較低的情況。同時，也有研究表明當數據呈嚴重刪失或呈高度偏態時，使用非參數的KM法進行處理效果更優[44]。然而，當數據集的樣本量較大時，選擇非參數估計法進行刪失數據的處理具有一定的局限性。

2.4 多重填補法

MI法基于貝葉斯理論，在替代法（即用一個單一值替代每個ND值）的基礎上作出改進，從觀測值的后驗概率分布中隨機抽取一系列（m個）合理的填充值替代每個ND值，通過創建若干個完整數據集再對每一完整數據集分析后綜合得到結果[21]。MI法需要所有參與分析的變量服從聯合概率分布。2014年，美國國家環境保護局提出用MI法來處理刪失數據將更為嚴謹[45]。Lin等[46]在一個艾滋病臨床試驗的案例研究中將多變量縱向數據中的ND值進行多重填補，結果表明在刪失比例較高的縱向數據處理中，MI法優于其他刪失數據分析方法。Canales等[47]比較了替代法、服從對數正態分布假設的MLE法、KM法、基于對數正態分布估計參數的MI法和基于均勻分布估計參數的MI法這5 種方法在低、中和高3 種刪失程度的左刪失數據處理中的應用情況，結果表明兩種MI法的數據處理效果優于其余3 種方法。同時，該作者又提出這兩種MI法是通過使用R語言中自帶的程序包實現的，未考慮分布誤選的因素。因此，在刪失數據的處理中，有必要在MI法中納入更多合理的分布模型以提高數據擬合的準確性。MI法雖在刪失數據的無偏估計中占有優勢，但其在反復填補ND值時往往會占用較大內存，比較耗時。

綜上，在選擇合理的刪失數據分析方法時，除依據均方根誤差或偏差等統計學評價指標的比較外，更應側重于對所需擬合分析的食源性致病菌污染檢測數據特征進行判斷，如數據集樣本量的大小、數據集內刪失數據的類別或數據集的刪失比例等。因此，將刪失數據分析方法應用于食源性致病菌的污染水平估計時，需考慮食源性致病菌污染檢測數據刪失情況的不同。

3 數據刪失情況下的食源性致病菌污染水平估計

食品中致病菌污染水平的確定取決于對致病菌污染檢測數據的準確估計。由于檢測方法的限制，食源性致病菌的污染檢測數據集中往往會包含一定比例的左刪失數據、右刪失數據或區間刪失數據?；诓煌悇e的刪失數據特征，綜合前述的食源性致病菌刪失數據常用分析方法，可應用于不同評估要求食源性致病菌污染水平的估計。

3.1 左刪失或右刪失數據下的致病菌污染定量估計

食品中致病菌的污染水平通常較低，在定量檢測數據中左刪失數據（＜LOQ）的占比要遠遠高于右刪失數據，且致病菌檢測中出現的右刪失數據可通過連續稀釋到適宜梯度進行濃度計數，因此針對于食源性致病菌污染檢測數據中左刪失數據處理分析的研究居多?；谑称凡蓸蛹爸虏【鷻z測所得到的定量數據，對其左刪失數據進行處理分析，將對風險的預測具有顯著影響。Duarte等[48]通過區分微生物檢測中的真實“0”值和人為“0”值（即小于LOQ的左刪失數據），開發一種新的模型進行微生物濃度分布及患病率的估計，結果表明正確處理檢測中得到的“0”值是準確表征微生物總體污染水平的關鍵之一，且微生物濃度分布和患病率的估計具有較高的相關性。Duque等[49]從法國4 個不同屠宰場中進行雞胴體樣本采集并開展空腸彎曲桿菌的檢測，將包含左刪失數據和未包含左刪失數據的兩個數據集進行比較，并通過正態分布、對數正態分布和伽馬分布3 個模型進行數據擬合，結果表明正態分布擬合效果最優。由正態分布擬合到的彎曲桿菌濃度平均值為2.74 （lg（CFU/g）），且不確定性范圍縮小至1（lg（CFU/g）），進而較精準地定量了雞胴體中空腸彎曲桿菌的污染水平。Cantoni等[50]在對飲用水和地下水中微量污染物檢測中的左刪失數據分析處理時，首先選擇對數正態分布、正態分布、Weibull分布和伽馬分布等模型進行擬合，再通過MLE法進行參數估計，可更精確地進行水質分析（如水源中污染物隨時間的變化趨勢和對污染物的處理效率），從而更有利于評價人類健康風險。因此，在食源性致病菌污染檢測數據的定量估計中，左刪失數據扮演著重要的角色，根據數據集特征的多樣性來選取恰當的統計分析方法是保證致病菌準確定量估計的關鍵。

3.2 區間刪失數據下的致病菌污染定量估計

在食源性致病菌的監測工作中，傳統定量檢測方法實驗周期長，需耗費大量人力物力，因此多用定性方法檢測致病菌，與此同時造成致病菌定量數據的大量缺失。如何將致病菌的定性數據有效轉化為定量數據，是目前開展QMRA的難點之一。

定性檢測方法和定量檢測方法具有不同的檢測限、敏感性和特異性，這使得在定性數據和定量數據的比較中可能會存在一部分區間刪失數據。對區間刪失數據進行正確的處理分析有助于提高食源性致病菌定性數據到定量數據轉化過程中的精確性。Jarvis[51]基于食品中致病菌服從泊松分布的假設，提出了一種基于定性檢測數據來確定一批樣品中致病菌平均污染濃度的有效方程。目前，該方程已廣泛用于只有定性檢測數據的食品樣品中致病菌的定量估計。Andritsos等[52]對豬肉糜中單增李斯特菌首先基于PALCAM、ALOA和RAPID’L.mono 3 種不同的選擇性培養基進行傳統定性檢測，得到陽性率分別為16%、19%和26%，再經分子生物學方法鑒定，對多種檢測方法下的數據進行真實陽性、真實陰性、假陽性和假陰性等多組數據集的整理，并基于不同檢測方法敏感性和特異性的計算，得出豬肉糜中單增李斯特菌的真實污染率為22%。隨后假設豬肉糜中單增李斯特菌服從泊松分布，并構建真實污染率和敏感性的關系式，進而估計出豬肉糜中單增李斯特菌的濃度為14～17 CFU/kg，實現定性數據到定量數據的轉化。隨后，Sun Wanxia等[53]在此基礎上，假設熟肉制品中的單增李斯特菌服從零膨脹分布（即零膨脹泊松分布或零膨脹泊松對數正態分布），并基于貝葉斯方法對熟肉制品中單增李斯特菌濃度進行估計，構建了一種基于定性數據的定量轉化概率模型。

目前，傳統致病菌檢測方法向基于分子生物學技術等快速檢測方法轉變的趨勢越來越明顯。這些快檢方法所得數據將生成定量數據，最終需要轉化為致病菌的濃度。根據檢測方法的不同，其檢測限具有較大差異，因此在區間刪失數據處理模型的選取方面應考慮該模型是否允許不同檢測限的輸入。Kato等[54]提出了一種基于截斷對數分布的貝葉斯隨機模型，可允許不同樣本不同LOD的輸入，并將此模型用于環境水樣檢測中指示菌和致病菌在基因水平上濃度比的估計。Poma等[55]使用qPCR對水樣中的諾如病毒和腸炎病毒進行定量檢測，并將低于方法LOD的刪失數據使用樣本檢測限值（the sample limit of detection，SLOD）的不同形式進行替代，即SLOD、SLOD/2、SLODa（average SLOD）、SLODm（median SLOD），以保證每個樣本檢測值的唯一性?；诖朔椒▽⑺畼又兄Z如病毒和腸炎病毒檢測的qPCR定量數據轉化為污染水平，并結合不同的暴露場景，開展進一步的定量風險評估。隨著檢測方法的更新及組學技術的發展，食源性致病菌定量風險評估不應局限于傳統定量檢測下的致病菌定量數據，充分利用新檢測技術下的數據，確保多種數據信息在致病菌定量估計中具有同等的有效性，是當下開展新一代定量風險評估的突破口之一[56-58]。

準確估計食品中致病菌的污染水平是降低風險評估不確定性的前提條件。綜上所述，選擇恰當的方法處理刪失數據可一定程度上彌補檢測信息的不足，避免食源性致病菌污染水平的有偏估計，減少風險評估過程中不確定性的產生。同時，不可忽視食源性致病菌污染檢測數據的變異性因素對最終結果的影響。變異性是由特定群體在時間、空間或個體上呈現的風險異質性產生，為固有屬性[59]。如何在食源性致病菌污染檢測刪失數據處理的基礎上納入其檢測數據的變異性分析仍是目前實現食源性致病菌污染定量估計精準化的瓶頸之一。致病菌在不同的食品基質中具有不同的空間分布特征，在固體及粉末狀食品中多呈集群（cluster）分布[60]。若某批次內的食品中致病菌呈集群分布，由于采樣的隨機性，通過檢測可得的致病菌定量數據往往會呈現出較大的變異性，主要體現在致病菌污染的季節變異性、批次間變異性、批次內變異性和菌株變異性等。為更好地描述變異性，一方面食源性致病菌的風險監測計劃應更具體且全面，需充分考慮采樣時間、采樣點、樣品類別、檢測方法、采樣批次/樣本/分析單元等信息的有效收集。Mikkela等[61]通過構建采樣批次-樣本-分析單元的分層結構，并提出了一個基于貝葉斯理論的時序-污染率-濃度模型，對呈高度異質性的雞肉中彎曲桿菌的檢測數據進行處理分析，以精準估計雞肉中彎曲桿菌的定量水平用于進一步的風險評估。另一方面，需要在相關模型的構建及軟件程序應用的更新方面推進研究。1992年，Frey[62]提出二維蒙特卡洛模擬（two-dimensional Monte-Carlo simulation，2D-MC）方法，可用來估計由于參數不確定性引起的風險估計的不確定性。由于2D-MC可通過對風險評估中的變異性因素和不確定性因素分別抽樣來反映兩者的分布情況，并能在輸出結果中分別估計變異性和不確定性，故該方法在QMRA領域已被廣泛應用。Pouillot等[63]開發了用于建立和研究2D-MC的R語言工具包，可直接將QMRA中的變異性和不確定性因素分開估計，風險評估人員可利用工具包首先對變異性進行分析估計，后在此估計基礎上再評估不確定性，為后續風險評估研究的進一步開展提供了便利。因此，在開展食源性致病菌的定量風險評估時，評估人員應謹慎分析致病菌污染檢測數據的變異性及污染信息不足導致的不確定性，確保評估結果的準確性，進一步加強風險監測、風險評估和風險管理的互動交流。

4 結 語

食源性致病菌的污染檢測數據中往往包含大量的刪失數據。根據數據集的刪失特點，選擇恰當的分析方法進行數據處理，利用轉化后的食源性致病菌濃度可較準確地估計人群患病風險。因此，刪失數據的分析研究在食源性致病菌定量風險評估中具有實際意義。在此基礎上，評估人員還需關注食源性致病菌污染檢測數據的變異性，實現對致病菌污染水平估計的精準化，以進一步推進我國食源性致病菌污染定量的建模工作。綜合國內外有關微生物檢測中刪失數據處理分析的研究現狀及我國食源性致病菌污染檢測數據的定量估計所存在的問題，提出如下建議：1）當前用于刪失數據分析的相關模型在數據特征及處理條件方面均存在或多或少的局限性，應在統計學領域嘗試更多有用模型的組合，如在MLE法的分布假設時考慮結合最優分布模型的選擇，進一步優化方法使其更符合數據條件，從而降低食源性致病菌風險評估的不確定性；2）應進一步推進食源性致病菌的風險監測工作，以不同監測批次為縱向檢測目標，以同一監測批次下致病菌的定性數據、定量數據和分子分型數據等作為橫向檢測目標，進行同一批次下多橫向監測數據和同一橫向檢測目標下多縱向監測數據的收集，實現致病菌風險監測指標多維化，挖掘不同食品基質中致病菌污染數據的變異性因素，實現監測大數據的有效整合；3）隨著當前食品安全檢測技術的不斷推進，培養組學、宏基因組和宏轉錄組等新技術下的多種檢測信息應被有效利用，對致病菌新型檢測污染數據進行定量轉化后用于暴露評估中是下一代定量風險評估工作的核心內容，可利用快檢方法的優勢提高風險預警能力。