青蒿琥酯抑制肺腺癌A549細胞的增殖及相關機制的研究

馬 暢,吳 桐,李 妍*

(吉林醫藥學院：a.免疫藥理學重點研究室,b.2017級衛生檢驗與檢疫本科班，吉林 吉林 132013)

肺癌是我國發病率及死亡率均占首位的惡性腫瘤，由于環境污染因素導致其發病逐年增加[1]。肺癌臨床治療可采用手術、放療或化療等，但耐藥發生率高且癌細胞遷移侵襲力強，目前患者5年生存率僅為4%～15%。按組織分型，肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，兩者分別占15%和85%。NSCLC又可分為肺腺癌(adenocarcinoma，ADC)、鱗癌和大細胞肺癌[2]。其中ADC占肺癌總發病率的80%，對其耐藥機制研究以及篩選拮抗化療耐藥制劑對改善臨床療效至關重要。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號轉導通路整合營養、細胞因子和生長因子信號，與腫瘤發生發展關系密切[3]。對人肺癌組織和A549等肺腺癌細胞研究表明，該信號通路過度活化可參與癌細胞增殖、抵抗凋亡、遷移和侵襲[4]。來源于植物黃花蒿的青蒿素和其多種衍生物具有抗瘧活性,其中青蒿琥酯(artesunate，ART)等對多種腫瘤具有抑制作用[5]。ART對肺癌增殖有何影響，是否可拮抗耐藥、轉移、侵襲相關信號，尚需實驗研究加以探討。本研究以體外培養的肺腺癌細胞A549為模型，研究ART對癌細胞增殖的抑制作用，并分析相關機制，闡述其在輔助肺癌治療中的價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

細胞培養液1640購自Gibco公司；ART購自上海源葉生物科技有限公司；MTT、DMSO購自美國Sigma公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)熒光探針(dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自碧云天生物技術有限公司；鼠抗人TSP50、S6K1、MMP-2抗體購自美國Abcam公司；HRP標記二抗購自中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

液氮罐中取出凍存的A549細胞，37 ℃水浴中融化后用PBS洗滌細胞1次，用含10%胎牛血清的1640液中培養，每周傳代3～4次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 MTT細胞增殖實驗

調整細胞濃度為3×104/mL，按照每孔100 μL接種于96孔板，加入含ART的培養液100 μL，使其終濃度分別為0、25、50、100和200 μmol/L，每個藥物濃度設3個，繼續培養72 h。檢測前4 h，每孔加入20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續培養4 h后，每孔加入DMSO 200 μL溶解還原產物。以不加MTT的對照組細胞為空白組，采用酶標儀測定570 nm波長處的吸光度值,計算細胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)。

1.4 細胞ROS檢測

接種細胞于6孔板，待細胞恢復生長后，加入ART至不同終濃度(0、25、50、100和200 μmol/L)。24 h后胰酶消化液消化和處理細胞，PBS洗滌細胞2次，200 μL重懸細胞，加入ROS熒光探針溶液避光染色30 min，PBS洗滌2次，流式細胞術檢測分析，以細胞內綠色熒光均值代表ROS水平。

1.5 細胞周期測定

取不同濃度青蒿琥酯處理后的細胞，PBS洗滌2次后，用5 mL 80%冷甲醇溶液固定細胞。檢測分析前離心棄去固定液，用PBS洗滌細胞2次，加入含PI和RNA酶的染液重懸細胞，避光染色30 min，流式細胞術分析。

1.6 免疫印跡技術

A549細胞設置對照組和100 μmol/L ART處理組，收集細胞并制備全細胞裂解液，參考文獻方法采用免疫印跡技術分析蛋白表達[6]。

1.7 統計學分析

實驗采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，組間比較采用t檢驗進行統計學分析，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結 果

2.1 ART抑制肺癌細胞A549的增殖

ART以濃度依賴方式抑制肺癌細胞A549生長，作用72 h的IC50值約為100 μmol/L(圖1)。

圖 1 ART對A549細胞增殖的抑制作用

2.2 青蒿琥酯對肺癌細胞周期的影響

不同濃度ART(0、25、50、100和200 μmol/L)處理A549細胞24 h后，流式細胞術分析細胞周期(圖2)。與對照組比較，伴隨藥物濃度增加，阻滯于G0-G1期細胞百分率增加，而S期和G2-M期細胞百分率逐漸降低。

圖 2 ART對A549細胞周期變化影響

2.3 ART促進A549細胞ROS生成

以ROS綠色熒光代表ROS的水平，與對照組相較，50～200 μmol/L青蒿琥酯藥物作用后，ROS含量顯著增加(*表示P<0.05)(圖3)。

圖 3 ART對人肺腺細胞A549的ROS的影響

2.4 ART對A549細胞3種蛋白表達或磷酸化的影響

為了進一步探討ART抑制A549細胞增殖的機制，設置對照組和藥物處理組(100 μmol/L ART)。24 h后收集細胞，采用免疫印跡技術分析蛋白激酶S6K1、TSP50、MMP-2表達變化，以及磷酸化S6K1磷酸化變化。ART對S6K1表達無影響，但對其S6K1磷酸化有下調作用，并抑制癌基因TSP50和基質金屬蛋白酶MMP-2表達(圖4)

3 討 論

肺癌不僅發病率高，且因為高耐藥率和易侵襲轉移而預后不良，患者生存期短。ADC約占肺癌總病例的80%，其侵襲、轉移和耐藥的機制復雜[2-3]。

A：對照；B：100 μmol/L ART圖 4 ART對A549蛋白表達的影響

PI3K/AKT/mTOR信號通路是調節細胞代謝和生長關鍵信號通路[7]。該信號通路在肺癌中存在多環節導致的過度激活，包括其上游的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變，抑癌基因PTEN等突變或缺失，以及PI3K和AKT自身表達增加等。研究表明，NSCLC細胞株中90%以上存在PI3K/AKT/mTOR過度激活；約70% NSCLC組織存在PTEN蛋白水平降低或不表達[8]。該信號通路過度激活促進細胞分裂增殖、抗凋亡，并參與腫瘤微環境中血管新生和免疫細胞分化調節。p70s6激酶1(p70s6 kinase1，p70s6K1)是其下游重要的絲蘇氨酸激酶，其激活將促進真核細胞蛋白翻譯起始環節，促進合成代謝和細胞分裂增殖[9]。本研究表明青蒿琥酯以濃度依賴方式阻滯細胞于G0-G1期，對p70s6激酶第389位氨基酸磷酸化具有抑制作用。該位點磷酸化是p70s6K1激活的標志，提示癌細胞增殖被抑制可能與藥物抑制蛋白翻譯有關。

細胞內ROS主要由線粒體能量代謝的過程中產生，包括羥基自由基、超氧陰離子、過氧化氫等。對于正常組織細胞而言，低濃度下ROS可促進細胞增殖、存活；但過量ROS則激活凋亡信號、誘導細胞凋亡[10]。ROS對腫瘤的作用具有兩面性，一方面過量ROS損傷DNA致基因突變，通過促發細胞畸變而參與腫瘤發生；另一方面ROS可通過上調Bax、激活JNK激酶、促進Beclin-1表達等誘導腫瘤細胞凋亡或自噬性細胞死亡[11-13]。相對于正常細胞，腫瘤細胞對ROS誘導的凋亡更敏感。合理地增加細胞內ROS，已成為篩選抗腫瘤藥物的重要策略?；瘜W藥物Elesclomol被FDA批準用于黑色素瘤治療，其抗腫瘤的主要機制是將ROS和氧化應激水平升高，對多種組織來源癌細胞具有較強誘導凋亡的效應[14]。Elesclomol與順鉑或卡鉑聯合治療NSCLC，患者用藥后無進展生存期和總存活期均較單獨應用順鉑或卡鉑治療組延長[15]。近年來，多種可促發ROS而抗腫瘤的中藥有效成分被用于臨床或進入臨床期研究，包括莪術醇、斑蝥素及其衍生物、羥基喜樹堿和白藜蘆醇等。通過對ROS偶聯信號的影響，這些中藥來源的藥效成分呈現促進癌細胞凋亡、增強腫瘤化療藥物的敏感性和逆轉耐藥等活性[16]。ART屬于倍半萜內酯類過氧化物，對乳腺癌、胰腺癌和消化道腫瘤的研究表明，其可抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。與以往報道類似，本研究也證實ART可增加A549細胞ROS產生。其單獨作用雖未顯著誘導細胞發生凋亡，但細胞周期阻滯效應明顯，并抑制了侵襲相關酶MMP-2表達，將ART用于肺癌的輔助治療可能發揮其拮抗腫瘤侵襲轉移的作用。

TSP50屬于CTA成員，在正常組織表達較低，但在乳腺癌、肺癌等腫瘤細胞中表達較高，是近年發現的新型腫瘤標志物[17]。腫瘤組織中TSP50的表達受基因組甲基化調節；體外培養的細胞在營養和生長因子信號刺激下，可通過Akt、mTOR和p70S6K1相關信號的激活，促進TSP50表達；抑制炎癥相關轉錄因子NF-κB下調TSP50表達。在乳腺癌中，其高表達與腫瘤淋巴轉移和生存期短相關。TSP50與肺癌的研究表明，在未分期NSCLC患者中其陽性率為73.6%，主要表達于胞漿中；TSP50與病理TNM分期相關，即其高表達與腫瘤大小、淋巴結轉移和浸潤范圍正相關[18]。這些研究報道提示，TSP50也可能是NSCLC治療或以后觀察的重要標志。本研究表明，ART可抑制A549細胞TSP50表達，可能與其抑制p70S6K1和其上游信號轉導有關。

概括而言，ART以濃度依賴方式抑制A549細胞增殖，導致癌細胞發生G0-G1期阻滯，激發ROS，下調p70S6K1磷酸化，并抑制TSP50和MMP-2表達。ART除抑制A549細胞增殖外，還可能具有激發ROS以及拮抗NSCLC轉移侵襲相關信號轉導。