復合益生菌和霉菌毒素降解酶對黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的同步降解

王曉敏，常 娟，王 平，尹清強 ，楊明凡，朱 群，胡驍飛，王全亮

（1.河南農業大學動物科技學院，河南鄭州 450046；2.河南農業大學動物醫學院，河南鄭州 450046；3.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉 453000；4.河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002；5.河南廣安生物科技股份有限公司，河南鄭州 450001）

霉菌毒素廣泛存在于自然界中，是由霉菌產生的有毒次級代謝產物（Hisako 等，2013），目前大約有100 多種真菌產生300 多種霉菌毒素（Pereira 等，2014）。我國是一個農業大國，小麥、玉米、花生等都是我國的主要農產品，但與此同時，我國也是霉菌毒素污染問題較為嚴重的國家之一。2018 年中國飼料和原料中霉菌毒素污染情況調查報告顯示，我國99.49%的飼料和原料存在霉菌毒素污染問題，其中85%以上的飼料和原料被2 種或2 種以上的霉菌毒素污染（雷元培等，2018）。飼料中常見且危害較大的霉菌毒素有黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）和嘔吐毒素（DON）等。這三種霉菌毒素能夠降低機體免疫力，具有致癌性、基因毒性和生殖毒性等，可嚴重危害機體健康（黃珂等，2019；劉艷麗等2012；Meissonmmier 等，2006；Wang 和 Groopman，1999），而且這些霉菌毒素的疊加毒性遠大于單一毒素的作用（韓文格和高建峰，2019）。因此，關于消除霉菌毒素危害的研究受到越來越廣泛的關注。傳統的物理和化學方法對于霉菌毒素的去除有一定的局限性，物理方法主要靠蒙脫石等的吸附功能，但存在著吸附譜窄、效價低、解吸附及吸附維生素和礦物元素等營養物質的缺點；化學方法通常會影響飼料的營養品質和適口性，降低飼料利用率，并存在安全隱患（Cao 等，2011；Yiannikouris 和Jouany，2002），難以大規模在生產中應用。生物解毒法包括微生物降解法和酶解法，具有高效、特異性強、環境友好、污染小的特點，因此近些年來成為人們研究的熱點（蔡俊等，2017）。趙雪芹等（2020）選擇遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌和米曲霉6 種益生菌來降解ZEA 和DON，結果表明，遲緩芽孢桿菌對DON 降解率達到79.59%，對ZEA 降解率達到46.93%。Shetty 等（2007）篩選出了兩株釀酒酵母，對AFB1的吸附能力分別為38.7%和36.1%，并提出起吸附作用的是其細胞壁上的碳水化合物或甘露聚糖。劉暢等（2010）篩選出了一株對AFB1的吸附率高達81.16%的釀酒酵母。鄭文秀等（2019）馴化的酪丁酸梭菌菌株對ZEA 的吸附率可達98.5%。這些都是利用益生菌去除單一霉菌毒素的研究，但實際生產中，一種飼料或飼糧往往受到多種霉菌毒素污染。其協同或疊加毒性對動物健康和生產性能的影響比單一霉菌毒素單獨作用的危害更大（李彥伸等，2020）。鑒于此，本研究通過將具有解毒功能的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌與霉菌毒素降解酶進行高效組合，研究其對AFB1、ZEA 和DON 三種霉菌毒素的聯合降解作用，為多種霉菌毒素的同步生物降解提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 AFB1和ZEA 購自Sigma 公司，DON 購自上海源葉生物科技有限公司，AFB1和ZEA 定量檢測試劑盒購自德國R-BiopHarm 公司，DON 定量檢測試劑盒購自江蘇省蘇微微生物研究有限公司?？莶菅挎邨U菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌和產生霉菌毒素降解酶的米曲霉均由河南農業大學動物營養與飼料生物技術研究室保存。

1.2 培養基的配制 LB 培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L。YPD 培養基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。丁酸梭菌培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉3 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，乙酸鈉3 g/L，可溶性淀粉1 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，pH為6.8 g/L。PDA 培養基：葡萄糖20 g/L，可溶性淀粉6 g/L，酵母浸粉2 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，蛋白胨5 g/L。上述培養基為固體時需要再加入2%瓊脂，用蒸餾水定容至1 L，在121 ℃、1.035×105Pa 條件下高壓蒸汽滅菌20 min 備用。米曲霉固體發酵培養基：麩皮∶豆粕∶玉米=7∶2∶1，固體：蒸餾水=5∶3，滅菌方法同上。

1.3 菌種的活化與培養 將實驗室保存的枯草芽孢桿菌接種到LB 培養基上，37 ℃、180 r/min條件下搖床振蕩培養24 h；釀酒酵母接種到YPD培養基上，30 ℃、180 r/min 條件下搖床振蕩培養24 h；丁酸梭菌接種到丁酸梭菌培養基上，37 ℃靜置狀態下培養24 h 后，分別按2%的接種量接入對應高壓滅菌后的新鮮培養基，再次培養24 h。菌種用平板涂布法測定活菌數，統一調整活菌數至1×108cfu/mL，活菌數用自然對數值lg 表示，菌種保存于4 ℃備用。

霉菌毒素降解酶的制備：挑取實驗室保存的米曲霉菌株，將其涂布于PDA 平板上，30 ℃靜置培養，3～5 d 有大量米黃色孢子產生，在平皿中加入5 mL 的滅菌生理鹽水，用涂布棒將平板上的孢子刮下，將其轉移至高壓滅菌過的米曲霉固體發酵培養基中并攪拌均勻，30 ℃靜置培養3～5 d，待有大量孢子產生時晾干。按照固液比1∶20 的比例，將米曲霉固體發酵培養物與生理鹽水混勻，攪拌2 h 后再靜置2 h，將浸泡液先用8 層紗布過濾，之后濾液在12000 r/min 條件下離心10 min，最后用0.22 μm 的濾膜過濾除菌后，保存于4 ℃冰箱待用。

1.4 復合益生菌最佳配伍比例的確定 采用拉丁方三因素三水平試驗設計，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌為拉丁方試驗設計的三個因素，1×105、1×106、1×107cfu/mL 為三種益生菌的三個活菌數水平。構建得到9 種復合微生物菌株組合來篩選優化益生菌組合，試驗分組見表1。根據本實驗室以前的研究結果，設置了高劑量毒素組（AFB1、ZEA、DON 分別為30、150、1500 μg/L）和低劑量毒素組（AFB1、ZEA、DON 分別為10、150、600 μg/L）。反應體系為5 mL，試驗組根據試驗設計加入3 mL MRS 培養基和1.5 mL 復合益生菌菌液，用生理鹽水調至5 mL。以相同體積的MRS培養基加等劑量的三種霉菌毒素作為空白對照，每個處理3 個重復，各組置于37 ℃、100 r/min 恒溫搖床中振蕩培養24 h，以AFB1、ZEA、DON 的降解率作為參考指標，優化得到復合益生菌的最優添加比例。

1.5 益生菌組合與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA、DON 的降解 根據表1 設計得到同時對AFB1、ZEA 和DON 降解效果最優的益生菌組合后，把復合益生菌的量定為1.5 mL，霉菌毒素降解酶的用量分別為0.05、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，最后用MRS 培養基調至5.0 mL。每個處理3 個重復，各組置于37 ℃、100 r/min 恒溫搖床中振蕩培養24 h，測定各組AFB1、ZEA、DON 三種毒素的降解率。

表1 復合益生菌降解AFB1、ZEA、DON 拉丁方試驗設計 lg cfu/mL

1.6 三種霉菌毒素降解率測定與計算 反應結束后，發酵液在10000 r/min 條件下離心5 min，取上清液按照檢測試劑盒步驟說明進行AFB1、ZEA、DON 降解率測定。AFB1降解率/%=（24 h 對照組AFB1含量-24 h 試驗組AFB1含量）/24 h 對照組AFB1含量×100；ZEA 和DON 降解率的計算方法同上。

1.7 數據統計分析 試驗數據經Excel 初步整理后，采用SPSS 25.0 軟件進行One way ANOVA單因素方差統計分析，利用Duncan’s 法進行多重比較，測定復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA、DON 的降解效果。所有結果均以“平均值±標準差”表示，以P ＜0.05 表示差異顯著，P ＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 高毒素組復合益生菌對AFB1、ZEA、DON三種毒素的降解效果 由表2 可知，高劑量霉菌毒素處理中，試驗1 組AFB1和DON 降解率最高，分別達到了40.55%和47.22%（P ＜0.05）。雖然試驗1 組ZEA 的降解率為56.05%，不是最高，但與ZEA 降解率最高組差異不顯著。把AFB1、ZEA 和DON 降解率相加得三者總降解率，試驗1組AFB1、ZEA 和DON 總降解率為143.83%，顯著高于其余各組（P ＜0.05）。各因素對霉菌毒素降解率影響的主次關系為A（枯草芽孢桿菌）＞B（釀酒酵母菌）＞C（丁酸梭菌）。極差分析顯示枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌最優添加比例為A1B1C1，即1×105、1×105、1×105cfu/mL，與試驗結果一致。表3 的結果顯示該試驗結果有效，其中A（枯草芽孢桿菌）對三種霉菌毒素的同步降解貢獻最大（P ＜0.01），與表2 的結果一致。

表2 高毒素組益生菌不同配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

表3 各因素之間的主體效應分析

2.2 低毒素組復合益生菌對AFB1、ZEA、DON三種毒素的降解效果 由表4 可知，低劑量霉菌毒素處理中，試驗1 組AFB1降解率最高為43.05%（P ＜0.05），雖然該組ZEA 和DON 的降解率不是最高，但與最高組差異不顯著（P ＞0.05）；該組AFB1、ZEA 和DON 降解率相加，得到霉菌毒素總降解率最高，為161.8%（P ＜0.05）。因而，仍把試驗1 組作為三種霉菌毒素降解的最佳組。各因素對霉菌毒素降解率影響的主次關系為A（枯草芽孢桿菌）＞B（釀酒酵母菌）＞C（丁酸梭菌）。極差分析顯示枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌最優添加比例為A1B1C1，即1×105、1×105、1×105cfu/mL，與試驗結果一致。表5 的結果顯示，該試驗結果有效，其中因素A（枯草芽孢桿菌）和B（釀酒酵母菌）對三種霉菌毒素的同步降解貢獻最大（P ＜0.01）。

表4 低毒組益生菌不同配伍比例對AFB1、ZEA、DON 的降解率（n=3）

表5 各因素之間的主體效應分析

2.3 高毒素組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 三種毒素的降解效果 由表6 可知，在高劑量霉菌毒素的降解試驗中，單一復合益生菌、單一霉菌毒素降解酶及復合益生菌與霉菌毒素降解酶比例為30∶1 時，對三種霉菌毒素的總降解率最高，分別到達了190.08%、175.10%和184.44%，顯著地高于其他組（P ＜0.05）。

表6 高毒素組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

2.4 低毒組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA、DON 三種毒素的降解效果 由表7 可知，在低劑量霉菌毒素的降解試驗中，單一霉菌毒素降解酶對三種霉菌毒素的總降解率最高，達到了219.23%（P ＜0.05）；其次為單一復合益生菌、復合益生菌與霉菌毒素降解酶比例為30∶1 和3∶2 時，對三種霉菌毒素的總降解率較高，分別達到了178.07%、181.84%和170.33%，顯著高于其他組（P ＜0.05）。

表7 低毒素組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

3 討論

3.1 復合益生菌對AFB1、ZEA 和DON 三種霉菌毒素的降解效果 許多學者對如何消除霉菌毒素對畜禽健康和生產性能的不良影響，降低霉菌毒素及其代謝產物在畜產品中的殘留等方面作了大量研究。結果證明，微生物降解對霉毒素的去除效果要優于傳統的物理和化學脫毒方法（張俊南等，2019；劉水靈等，2018；Farbo 等，2016；李文明，2013）。梁含等（2019）從土壤和發霉秸稈等材料中篩選的淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對DON 的降解率分別為19.1%和51.3%。將兩種菌株組合后對DON 的降解率可達71%。何潤霞（2016）篩選出14 株降解ZEA 的細菌，其中一株紅球菌對ZEA 降解率達87.1%。研究已經證實，許多真菌能夠將AFB1降解成低毒或無毒的產物（王佳興等，2020；Rushing 和Selim，2018）。本研究結果表明，將枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌進行有效配伍，可有效同步降解AFB1、ZEA 和DON，優于前人對單一毒素的降解，更切合生產實際。這些復合益生菌除具有降解多種霉菌毒素外，還具有調節動物胃腸道微生物區系，提高機體健康和免疫力的功效，對于畜牧業的健康和安全生產意義重大。

3.2 復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解效果趙雪芹等（2020）將米曲霉與AFB1共培養，AFB1降解率為46.93%。左瑞雨（2012）篩選到一株米曲霉，其所分泌的酶制劑對AFB1降解率達到77.0%，當該酶制劑與枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌配伍后，可更有效地降解AFB1（左瑞雨等，2018）。王開萍等（2015）從土壤樣品中篩選出一株能夠降解DON的米曲霉，降解率達到60%以上。劉超齊（2017）等將復合益生菌（枯草芽孢桿菌K3、枯草芽孢桿菌K4 和產朊假絲酵母）與來自米曲霉的霉菌毒素降解酶配比為2∶1 時，對ZEA 降解率達到95.15%。米曲霉在發酵培養過程中可以產生多種酶系，能夠促進動物對營養物質的消化吸收利用，其分泌的胞外酶還可以降解多種霉菌毒素（Garda-Buffon 和Badiale-Furlong，2010）。通過復合益生菌與霉菌毒素降解酶的配伍試驗可以看到，無論是高劑量或是低劑量霉菌毒素存在，單一的復合益生菌或者單一的霉菌毒素降解酶都可提高其對AFB1、ZEA 和DON 總降解率。雖然復合益生菌與霉菌毒素降解酶的配伍也可以提高AFB1、ZEA 和DON 總降解率，但是兩者配伍的優勢沒有體現出來?？紤]到該產品未來將在動物胃腸道發揮作用，因而單一復合益生菌、單一霉菌毒素降解酶及適宜的復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍，都將會在多種霉菌毒素的同步降解中發揮重要作用，對畜禽健康養殖和畜產品安全生產具有重要意義。

4 結論

本試驗結果表明，復合益生菌、霉菌毒素降解酶或兩者適宜的配伍均能有效降解AFB1、ZEA 和DON，為畜牧業和飼料業生產中消除多種霉菌毒素對動物的危害奠定了基礎。