響應面法優化玉米蛋白粉飼料發酵工藝

江成英，劉曉蘭，王 松

（1.梧州學院化學工程與資源再利用學院，廣西梧州 543000；2.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

玉米蛋白粉是玉米加工后的具有高能量、高蛋白質的副產品，常作為一種飼料資源在畜禽飼料中使用（楊露等，2018）。但其氣味特殊、口感不好、水溶性差、缺乏必需氨基酸等缺點，導致畜禽對玉米蛋白質的利用率相對較低，從而限制了其在飼料中的應用（趙謀明等，2019）。對玉米蛋白粉進行加工處理，提高其蛋白的水溶性是解決這一問題的關鍵。目前，常用處理方法有物理法、酶解法和微生物法。微生物發酵過程中產生的蛋白酶類能夠將蛋白粉中難以被吸收利用的植物大分子蛋白質降解為分子質量較小的多肽、小肽或游離氨基酸，從而提高其蛋白的利用率（向麗蓉等，2019）。王念祥等（2009）利用好食脈孢霉發酵玉米蛋白粉，使蛋白粉的蛋白質溶出率達到25.31%。魏炳棟等（2017）研究表明，利用復合菌發酵玉米蛋白粉后，其粗蛋白質、多肽和總必需氨基酸含量均明顯增加。王松等（2019）采用紫外誘變的方法,篩選出一株枯草芽孢突變菌株，可將玉米蛋白粉飼料中的可溶性蛋白轉化率由原始菌株的37.39%提高到47.83%。

本試驗以添加一定比例麩皮的玉米蛋白粉為原料，進行多菌種混合固態發酵飼料的制備，在單因素試驗的基礎上，采用4 因素3 水平的響應面分析法，優化發酵工藝，為玉米蛋白粉發酵飼料的生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌均由齊齊哈爾大學生物工程實驗室提供。

1.2 原料 玉米蛋白粉：中糧生化能源（龍江）有限公司提供；麩皮：市售。

1.3 試劑 酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鈉、酚酞、鎢酸鈉、鹽酸、酵母粉、鉬酸鈉、磷酸、胰蛋白胨、硫酸鋰、液溴、葡萄糖、瓊脂等試劑均購自天津市凱通化學試劑有限公司。

1.4 主要儀器 SYQ-DSK-280B 型手提式壓力滅菌器（上海申安醫療器械廠），TU-1810 型紫外可見分光光度計（日本島津儀器廠），PHS-25 型數顯pH 計（上海精密科學儀器有限公司），ZHJH-C2109C 型超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司），BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器廠），PYX-DHS-40×50-BS-I 型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）等。

1.5 試驗方法

1.5.1 可溶性蛋白含量的測定 采用福林酚法測定可溶性蛋白含量（王永華，2010）。

1.5.2 單因素試驗 將玉米蛋白粉與麩皮以一定比例混合，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入混合菌種（枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1 的比例混合）進行固態發酵，通過測定發酵物料中的可溶性蛋白含量研究物料比、料水比、發酵溫度、發酵時間和接種量對發酵飼料的影響。

1.5.3 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據中心組合試驗設計（CCD）原理，以可溶蛋白含量為響應值，使用Design-Expert8.0.5 軟件，選取料水比（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）及發酵時間（D）為自變量，采用4 因素3 水平的響應面法對試驗結果進行優化，以確定最佳的發酵工藝條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于30 ℃進行固態發酵，48 h 后每隔12 h 檢測發酵底物中的可溶性蛋白含量。結果見表2。

表2 發酵時間對可溶性蛋白含量的影響

2.1.2 發酵溫度對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種分別于28、30、32、34 ℃進行固態發酵，84 h 后檢測發酵底物中的可溶性蛋白含量。結果見表3。

表3 發酵溫度對可溶性蛋白含量的影響

2.1.3 物料比對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮分別以4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 的比例混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于32 ℃進行固態發酵，84 h 后檢測發酵底物中的可溶性蛋白含量。結果見表4。

表4 物料比（玉米蛋白粉：麩皮）對可溶性蛋白含量的影響

2.1.4 接種量對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 的比例混合，料水比為1：1.1，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后分別接入1%、5%、8%、10%、15%的混合菌種于32 ℃進行固態發酵，84 h 后檢測發酵底物中的可溶性蛋白含量。結果見表5。

表5 接種量對可溶性蛋白含量的影響

2.1.5 料水比對可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 的比例混合，料水比分別為1：1、1：1.2、1：1.4、1：1.6，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于32 ℃進行固態發酵，84 h 后檢測發酵底物中的可溶性蛋白含量。結果見表6。

由單因素試驗結果可以看出，可溶性蛋白含量最高的單因素條件分別為：物料比7：3，料水比1：1.2，發酵時間84 h，發酵溫度32 ℃，接種量15%。但15%接種量與5%接種量的可溶性蛋白提高不是很大，綜合考慮經濟因素，初步確定多菌種固態發酵玉米蛋白飼料的工藝條件為：物料比（玉米蛋白粉：麩皮）7：3，料水比1：1.2，發酵時間84 h，發酵溫度32 ℃，接種量5%。

2.2 響應面法優化發酵工藝

2.2.1 模型的建立與顯著性分析 在單因素試驗基礎上結合Box-Behnken 設計，選取原料物料比例為7∶3、混菌比例為1∶1∶1，以料水比例（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為影響因子，以可溶蛋白含量（Y）為響應值，設計4 因素3 水平響應面試驗，以優化發酵玉米蛋白粉飼料的工藝參數，結果見表7。

表7 響應面設計及結果

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對試驗數據進行回歸模型方差分析，結果見表8。

表8 回歸模型方差分析

用Design-Expert.V8.0.5 軟件對試驗結果進行多元回歸方程擬合，獲得以感官評分為目標函數的二次回歸擬合方程：

Y=12.56 +1.11A +0.25B +0.098C +0.30D +0.13AB-0.055AC-0.025AD+0.080BC-0.035CD-0.29A2-0.034B2+0.051C2-0.31D2。

由表8 可知，用響應面法建立的二次回歸模型極顯著（P ＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.0892＞0.05），說明所得模型擬合程度較好，該回歸模型能夠很好地對響應值進行預測。一次項B、一次項D、二次項A2和二次項D2為顯著（P ＜0.05），一次項A 為極顯著（P ＜0.01），交互項不顯著（P ＞0.05）。各因素對發酵玉米蛋白粉飼料可溶蛋白含量的影響強弱次序為料水比例（A）＞發酵時間（D）＞接種量（B）＞發酵溫度（C）。

2.2.2 響應面分析結果 各因素交互作用對可溶性蛋白影響的響應面圖見圖1。

圖1 各因素交互作用對可溶性蛋白影響的響應面

2.2.3 發酵工藝的優化與驗證結果 經Design-Expert8.0.5 軟件優化處理后，得到發酵玉米蛋白粉飼料的最佳工藝條件為：原料物料比例7∶3、混菌比例1∶1∶1、料水比例1：1.3、接種量6%、發酵溫度33 ℃、發酵時間87.08 h。

為了驗證響應面優化的可行性，將響應面優化方案修約后的工藝條件進行3 組平行發酵試驗，3 個試驗組發酵飼料中可溶蛋白含量平均值可以達到13.77%，與理論預測值13.8894%的相對誤差為0.85%，與試驗結果相符。

3 結論

以多菌種組合進行固態發酵玉蛋白粉飼料的制備，通過單因素及響應面試驗確定了最佳發酵工藝條件為：將玉米蛋白粉與麩皮以7：3 的比例混合，料水比為1：1.3，于121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫后接入6%的混合菌種（枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1 的比例混合），于33 ℃條件下固態發酵87.08 h。在此條件下，發酵飼料中可溶蛋白含量可達13.77%，可用于發酵玉米蛋白粉生產飼料。