基于網絡藥理學及分子對接技術探討定喘湯治療兒童咳嗽變異性哮喘的作用機制

程爽，李園，張子薇，方順順，呂顯威，孫洮玉 (北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100007)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是兒童慢性咳嗽常見的原因之一[1]，以咳嗽為唯一或主要表現[2]。有報道指出，如不干預治療，約30%的CVA會轉變為典型哮喘，影響患兒身心健康[3-4]。目前西醫治療CVA以吸入性糖皮質激素、支氣管舒張劑和口服白三烯受體拮抗劑為主。但我國兒童哮喘的病情控制并不理想，有20%以上兒童哮喘未達到良好控制[5]。中醫既往論著中并沒有CVA對應的病名，許多醫師根據自己對本病的認識提出了哮咳、風咳等觀點[6-7]，在治療上積累了不少經驗，其中就包含定喘湯的應用[8-11]。

定喘湯見于《攝生眾妙方》，為宣肺降氣、化痰平喘的經典方劑，方中共有麻黃、白果、桑白皮、黃芩、蘇子、杏仁、半夏、款冬花、甘草9味中藥。定喘湯臨床用于支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病的治療[12-13]?，F代藥理研究證明定喘湯具有化痰、平喘、抗炎等作用[14]。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統進行網絡分析，選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科，其突出特點是強調對信號通路的多途徑調節，以提高藥物的治療效果。而中藥復方制劑恰恰具備多成分、多功效的特點，與網絡藥理學具有很高的相似性。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術，預測并驗證定喘湯治療CVA可能的作用機制，為進一步開發藥物提供參考。

1 方法

1.1 工具

數據庫：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，網址https://tcmspw.com/tcmsp.php；全球蛋白質資源(universal protein resource，UniProt)，網址https://www.uniprot.org/；基因卡片(GeneCards)，網址https://www.genecards.org/；在線《人類孟德爾遺傳》(online Mendelian inheritance in man，OMIM)，網址https://www.omim.org/；String，網址https://string-db.org/；用于注釋、可視化和集成發現的數據庫(the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID)，網址https://david.ncifcrf.gov/；PubChem，網址https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/；蛋白質數據庫(Protein Data Bank，PDB)，網址https://www.rcsb.org/。

軟件：Excel 2020；Cytoscape 3.7.2；Chemoffice；PyMOL；AutoDock Vina；AutoDockTools。

繪圖工具：微生信網站，網址http://www.bioinfor-matics.com.cn/。

1.2 定喘湯活性成分及靶點

利用TCMSP數據庫獲取定喘湯中9種藥物的所有成分，將口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件，篩選出活性成分。此外，通過查閱已發表的文獻，補充因篩選指標而被舍棄的活性成分。通過TCMSP獲取活性成分的作用靶點，將結果導入UniProt中，選擇已驗證的、人源性基因，將靶點轉化為標準化的基因名。

1.3 CVA疾病靶點篩選

通過GeneCards輸入關鍵詞“cough variant asthma”，按照相關性得分(relevance score)取前25%的疾病靶點，獲取CVA疾病靶點；通過OMIM獲取全部CVA疾病靶點，取兩個數據庫靶點交集得到CVA疾病靶點。

1.4 定喘湯藥物靶點和CVA疾病靶點交集

運用Excel 2020得到藥物靶點與疾病靶點的交集靶點，利用微生信網站制作韋恩圖。

1.5 構建“中藥-活性成分-靶點”調控網絡和蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件，構建“中藥-活性成分-靶點”調控網絡，通過網絡拓撲分析篩選出Degree≥2倍中位數的核心成分。將“1.3”項得到的交集靶點導入String數據庫，設定物種為人(homo sapiens)，互動分數(interaction score)≥0.4，獲取PPI網絡數據，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建PPI網絡，篩選節點Degree≥2倍中位數的節點，獲取核心靶點。

1.6 基因生物過程分析(GO-BP)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析

將交集靶點導入DAVID數據庫，進行GO-BP和KEGG通路富集分析，獲取交集靶點的關鍵生物進程和通路信息，分析定喘湯治療CVA的可能機制。

1.7 分子對接

在PPI網絡得到的核心靶點中選取排名前三的核心靶點，在“1.5”項“中藥-活性成分-靶點”網絡中篩選出 3個核心靶點共同對應的活性成分，并將所得活性成分與“1.5”項獲得的核心成分取交集。利用PubChem數據庫獲取核心成分的2D結構，并用Chemoffice軟件將2D結構轉化為3D結構，即可得到小分子配體。利用PDB數據庫獲取核心靶點蛋白質的3D結構，利用PyMOL軟件去除靶點蛋白的水分子和小分子配體，即可得到蛋白受體。利用AutoDockTools軟件將小分子配體和蛋白受體文件轉化為pdbqt格式，再利用AutoDock Vina軟件將 3個核心靶點與交集核心成分進行分子對接。

2 結果

2.1 定喘湯活性成分及靶點

篩選得出活性成分194個，查閱已發表的文獻補充活性成分24個，共計218個。通過TCMSP得到活性成分的潛在靶點452個。

2.2 CVA疾病靶點

在GeneCards中按照相關性得分取前25%的疾病靶點，獲取CVA疾病靶點563個，通過OMIM獲取CVA疾病靶點146個，取兩個數據庫靶點交集得到CVA疾病靶點689個。

2.3 定喘湯藥物靶點和CVA疾病靶點交集

運用Excel得到藥物靶點與疾病靶點的交集靶點131個，并制作韋恩圖，見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點

2.4 “中藥-活性成分-靶點”調控網絡與PPI網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件，構建“中藥-活性成分-靶點”調控網絡(圖2)。網絡中的節點為藥物名稱、活性成分、靶點，邊為活性成分與基因之間的相互關系。靶點用藍色菱形表示，9種藥物的活性成分分別用9個圓環表示，圓環圓心代表藥物名稱，兩側兩列活性成分為不同藥物中的相同活性成分。根據Degree進行網絡拓撲分析和網絡可視化調節，Degree越大，該節點在網絡中連接的點越多，影響力越強。篩選出Degree≥2倍中位數的中藥成分22個，見表1，這些中藥成分可視為定喘湯治療CVA的核心成分。

圖2 “中藥-活性成分-靶點”調控網絡

表1 定喘湯治療CVA的核心成分

將131個交集靶點導入String數據庫，構建PPI，將結果導入Cytoscape 3.7.2軟件(圖3左)，先后篩選Degree≥1倍中位數(圖3中)、Degree≥2倍中位數的節點(圖3右)，獲取關鍵靶點，所得靶點可視為定喘湯治療CVA的核心靶點。

圖3 蛋白互作網絡與核心靶點

2.5 GO和KEGG富集分析

將131個交集靶點導入DAVID數據庫，進行GO和KEGG富集分析，得到生物過程720條，主要與RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的調控、對藥物的反應、細胞增殖、炎癥反應、對脂多糖的反應、細胞凋亡、免疫反應、一氧化氮(NO)生物合成、MAPK級聯激活等有關；通過KEGG富集得到121條通路，主要涵蓋PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等。分別選取排名前20的生物過程及通路制作氣泡圖，見圖4、圖5。

圖4 GO-BP分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接

分別將槲皮素、木犀草素、白藜蘆醇、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]、漢黃芩素與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)進行分子對接，結果顯示15組分子對接結合能均≤-6.6 kcal/mol，展現出良好的結合力，見表2。其中，AKT1和IL-6與EGCG結合最好、TNF與木犀草素結合最好，見圖6。

表2 核心成分與核心基因結合能量 kcal/mol

圖6 分子對接結果(從左到右依次是EGCG與AKT1、EGCG與IL-6、木犀草素與TNF)

3 討論

目前，CVA的治療仍以西醫治療為主，目的在于良好或完全地控制病情，預防未來風險的發生。然而有研究指出，患兒家長的疾病控制知信行現狀仍不理想[15]，患兒吸入糖皮質激素治療依從性僅為37.3%[16]。定喘湯中麻黃辛溫，宣肺平喘，解表散寒，白果甘澀，斂肺定喘，祛痰止咳，二藥合用，一散一收，共為君藥；桑白皮瀉肺平喘，黃芩清肺瀉熱，二藥合用，清肺降逆，共為臣藥；蘇子降氣化痰，杏仁止咳平喘，半夏燥濕化痰，款冬花下氣止咳化痰，俱為佐藥；甘草調和諸藥，且能止咳，為使藥。諸藥合用，外散風寒，內清痰熱，降氣平喘。中藥方劑的復雜性給作用機制的研究造成一定困難，本研究借助網絡藥理學和分子對接技術，為定喘湯治療CVA作用機制的研究提供新的思路和方法。

本研究共得到218個活性成分，核心成分22個。槲皮素、木犀草素、漢黃芩素均為黃酮類化合物，具有較強的抗炎抗氧化作用。研究表明，槲皮素和木犀草素能夠抑制血管內皮生長因子(VEGF)，從而發揮抑制CVA患兒氣道重構的作用[17]。白藜蘆醇是一種天然多酚，具有抗氧化、抗炎、保護心臟和抗癌的特性，實驗證明白藜蘆醇可以減輕纖維化反應和氣道炎癥，抑制肥大細胞中Syk蛋白的表達和脫顆粒[18]。EGCG是綠茶中的一種多酚，有研究表明它可顯著降低哮喘癥狀，肺炎性細胞浸潤以及IL-2、IL-6和TNF-α的炎性因子水平[19]。漢黃芩素可以通過調節Th1/Th2細胞因子平衡和肥大細胞釋放組胺，達到治療過敏性哮喘的作用[20]。漢黃芩素還可誘導嗜酸粒細胞凋亡并減輕變應性氣道炎癥[21]。

通過PPI網絡得到核心靶點，Degree位于前三的分別為AKT1、IL-6、TNF。其中，AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白參與多種生物學過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長、血管生成等[22]。IL-6是一種功能廣泛的多效應細胞因子，可以調節多種細胞的生長與分化，在慢性炎癥反應中扮演著重要角色。一項成人哮喘的研究結果顯示，IL-6與成人發作哮喘的風險相關[23]。另有研究發現，人支氣管上皮樣細胞(16HBE)中的SIRT1低表達可上調IL-6表達，而AKT抑制劑可逆轉該表達，SIRT1通過AKT調節IL-6水平，從而影響哮喘患者的肺功能[24]。TNF是一類涉及到系統性炎癥的細胞因子，主要由巨噬細胞分泌。一項埃及的研究表明，TNF-α基因多態性可能與兒童支氣管哮喘的發生有關，支氣管哮喘患者的TNF-α水平升高更為顯著[25]。

GO-BP分析主要涉及炎癥反應、對脂多糖的反應、NO生物合成、MAPK級聯激活等生物進程。有研究表明，脂多糖在亞洲沙塵引起的過敏性氣道炎癥中可增強中性粒細胞的聚集，從而加劇過敏性氣道炎癥[26]。NO已被證實有廣泛的生物功能，包括舒張血管、擴張支氣管、傳遞神經信號、參與炎癥反應和免疫等，臨床中呼出氣一氧化氮(FeNO)的測定也被公認為檢測氣道炎癥的指標[27]。MAPK是以三級激酶依次激活的方式進行信號傳導的，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，這三種激酶共同調節細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等眾多生物過程?，F代研究證實，卵白蛋白過敏哮喘小鼠模型暴露于臭氧環境時，哮喘癥狀會加重，而其中p38-MAPK和氧化應激均在此過程中起關鍵作用，抑制這兩個生物過程可顯著減輕暴露于臭氧環境的哮喘小鼠癥狀[28]。

KEGG富集分析結果顯示，定喘湯作用于CVA的靶點主要涉及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等。有研究[29]顯示，白藜蘆醇的抗炎特性可能是因為抑制了PI3K-Akt通路、從而減少炎性介質IL-6、NO的產生。TNF信號通路和Toll樣受體信號通路是反映炎癥的重要通路，有研究證明，哮喘丸治療哮喘可能通過抑制TNF信號通路和Toll樣受體信號通路相關蛋白質的表達和細胞因子的分泌，降低炎癥反應，增強機體免疫功能實現，且該研究證實其機制與孟魯司特鈉治療CVA的機制相似，能明顯抑制TLR4、MyD88、p65和p-p65等蛋白表達，且明顯降低哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α水平，提高IFN-γ水平[30]。

分子對接的結果提示定喘湯中的5個核心成分與AKT1、IL-6、TNF結合后均產生了良好的親和力，也驗證了本研究的結果。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對定喘湯治療CVA的活性成分、核心靶點以及可能的作用機制進行研究，并通過分子對接技術對上述結果進行驗證，證實了定喘湯治療CVA具有多成分、多靶點、多通路的特點，為進一步研究定喘湯治療CVA的作用機制提供了參考數據。