正交試驗聯合反向傳播人工神經網絡優選熄風止動顆粒提取工藝

王娣，陳娟，魯文靜，楊智峰 (陜西省中醫藥研究院，西安 710003)

熄風止動顆粒由天麻、石決明、菊花、鉤藤、全蝎、青葙子、佛手、辛夷、金果欖、胖大海、片姜黃、制白附子、玫瑰花、龍骨共14味中藥組成，具有養陰平肝、鎮靜祛風、滌痰通絡的功效，為一種臨床經驗方，主要用于治療兒童多動綜合征，經臨床多年驗證療效顯著、副作用小。該方常以湯劑應用于臨床，而湯劑存在服用劑量大、不便于攜帶及長期保存的弊端。顆粒劑具有載藥量大、穩定性好、便于攜帶及保存的優點[1]，可彌補湯劑的不足，因此本研究擬將該方開發為熄風止動顆粒。目前，中藥提取工藝的方法主要有正交試驗法、均勻設計法、響應面設計法等，其中正交試驗法最常用。正交試驗受限于因素水平的設定，篩選出來的最佳參數僅限于已設水平的組合，有一定局限性，而人工神經網絡(ANN)建?？梢源蚱七@一局限[2]。ANN是以生物學中樞神經網絡為基本原理，以網絡拓撲知識為理論基礎，模擬人腦的神經系統對復雜信息的處理機制的一種數學模型，近年來在中藥提取工藝方面應用廣泛，其中反向傳播人工神經網絡(BP-ANN)的應用最廣泛[3-4]。因此，本試驗以天麻素含量和干膏率的綜合評分為指標，在正交試驗結果基礎上聯合BP-ANN對熄風止動顆粒的提取工藝進行優化，確定最佳提取條件，為熄風止動顆粒的工業化生產提供實驗依據。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1260系列高效液相色譜儀，配置VWD檢測器和Agilent Chem Station工作站(美國安捷倫科技有限公司)；電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(中外合資重慶四達實驗儀器有限公司)；KQ-400DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平、BS210S型電子分析天平(賽多利斯天平有限公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑

天麻、石決明、菊花、鉤藤、全蝎、青葙子、佛手、辛夷、金果欖、胖大海、片姜黃、制白附子、玫瑰花、龍骨均購自廣州致信藥業有限公司，均符合《中國藥典》2015年版有關規定，經陜西省中醫藥研究院中藥研究所楊智峰研究員鑒定均為正品；天麻素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110807-201809，供含量測定用)；甲醇(HPLC級，Fisher)；磷酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；水為純化水。

2 方法

2.1 天麻素含量測定

2.1.1 色譜條件 Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動相為甲醇-0.05%磷酸(3∶97)，流速0.8 mL/min，檢測波長220 nm，理論塔板數按天麻素峰計算應不低于5 000，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定天麻素對照品2.1 mg至10 mL容量瓶，甲醇定容，再精密量取2 mL至10 mL容量瓶，定容，得含天麻素0.042 mg/mL的溶液。另精密稱定天麻素對照品1.44 mg至10 mL容量瓶，甲醇定容，得含天麻素0.144 mg/mL的溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取熄風止動顆粒處方量藥材共9份，按照正交試驗表各條件回流提取，提取液用100目篩網過濾，合并提取液。精密吸取所得提取液25 mL置于烘箱中，以60 ℃烘干，加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液制備 按熄風止動顆粒處方量稱取除天麻以外的其他藥材，按11倍加水量，回流提取1.0 h，提取2次，提取液用100目篩網過濾，合并提取液。精密吸取所得提取液25 mL置于烘箱中，以60 ℃烘干，加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.5 線性關系考察 精密吸取天麻素對照品溶液(0.042 mg/mL)，分別進樣1、5、10、15、20、25 μL，測定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，實際進樣量(X，μg)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=2 811.9X-2.154 3(r=0.999 8)。結果表明，天麻素進樣量在0.042～1.050 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.6 精密度實驗 精密吸取天麻素對照品溶液(0.042 mg/mL)10 μL，連續進樣6次，得天麻素峰面積的RSD為0.069%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性實驗 分別于供試品溶液放置0、2、4、6、8、10、12 h時，精密吸取10 μL進樣測定，得天麻素峰面積的RSD為1.12%，表明供試品溶液12 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性實驗 精密稱取同批樣品6份，制備供試品溶液，精密吸取10 μL進樣測定，得天麻素峰面積的RSD為1.15%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的熄風止動顆粒共6份，每份2.0 g，分別置于10 mL容量瓶中，精密加入0.144 mg/mL的天麻素溶液0.8、1.0、1.2 mL各2份，定容，按本方法測定，得天麻素平均回收率為98.66%，RSD為1.46%，說明該方法回收率良好。見表1。

表1 熄風止動顆粒中天麻素含量測定的加樣回收率實驗

2.2 干膏率測定

稱取熄風止動顆粒處方量藥材共9份，按照正交試驗表各條件回流提取，提取液用100目篩網過濾，合并提取液。分別量取50 mL放入已干燥至恒重的蒸發皿內，80 ℃烘箱烘干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于用凡士林封口的干燥器中冷卻30 min，精密稱質量，再于105 ℃烘箱中干燥30 min，再置于用凡士林封口的干燥器中冷卻30 min，精密稱質量，恒重后計算干膏率。

2.3 藥材吸水率實驗

稱取熄風止動顆粒處方量藥材，加水800 mL浸泡 1 h，回流提取 1 h，濾過，量取傾出溶液，計算藥材吸水率為339%。因此，考察提取工藝時，第1次提取應該多加水3.4倍量(按干藥材質量計，下同)。

3 正交試驗設計及結果

采用L9(33)正交試驗設計熄風止動顆粒提取工藝，以天麻素含量與干膏率的綜合評分為指標，對提取工藝的提取次數、加水量及提取時間等三個因素進行正交試驗。正交試驗因素水平、試驗設計及結果見表2、表3。由表3可知，提取因素對綜合評分[綜合評分=干膏率(%)×4+天麻素含量(mg)]的影響大小為提取次數>提取時間>加水量；由表2可知，提取次數的影響差異具有統計學意義。因此，應選擇A3B3D2，最佳提取工藝確定為處方量藥材加水浸泡1 h后，回流提取3次，第1次提取加水14.4倍量，第2、3次提取加水11倍量，每次提取時間1 h。

表2 熄風止動顆粒提取工藝正交試驗因素水平

表3 熄風止動顆粒提取工藝正交試驗及直觀分析

4 BP-ANN建模與應用

4.1 BP-ANN模型的建立

隨機選取9組正交試驗數據中的7組為訓練樣本，其余2組為測試樣本，利用SPSS MODELER 18.0軟件建立BP-ANN模型，其中輸入層的3個神經元設定為提取次數、加水量、提取時間，輸出層的1個神經元設定為綜合評分，進行訓練模擬。得到最優模型隱含層條件為隱含層1層，神經元10個。結果顯示，BP-ANN模型預測所得9組預測值與正交試驗數據真實值的平均相對誤差為0.783%，擬合系數為0.998，表示該BP-ANN模型訓練與預測精度較好，滿足試驗要求。見表4。

表4 正交試驗與BP-ANN模型預測比較

4.2 BP-ANN模型的仿真優化

將原有正交試驗中的因素水平增加并進行任意組合，正交試驗中提取次數1～3次，設為3個水平；提取時間為30～90 min，每間隔15 min設一個水平，共5個水平；加水量為7～11倍加水量，每間隔0.25倍加水量設一個水平，共17個水平。新增的因素水平任意組合可得到135種不同的組合，將這135種組合的數據引入輸入層，采用BP-ANN模型進行仿真優化，可得到輸出層的135個綜合評分，再進行最佳提取工藝的篩選，最終確定熄風止動顆粒的最優提取工藝為處方量藥材加水浸泡1.0 h后，回流提取2次，第1次提取加14.4倍量水，第2次提取加11倍量水，每次提取時間75 min，預測得到對應綜合評分為142.15。

4.3 驗證試驗

正交試驗優化的提取條件為處方量藥材加水浸泡 1 h 后，回流提取3次，第1次提取加水14.4倍量，第2、3次提取加水11倍量，每次提取時間1 h；BP-ANN模型優化的提取條件為處方量藥材加水浸泡1 h后，回流提取2次，第1次提取加水14.4倍量，第2次提取加水11倍量，每次提取時間75 min。分別進行驗證試驗，平行 3次，結果顯示，BP-ANN模型優化的提取工藝綜合評分高于正交試驗優化的提取工藝，不但可提高提取液中天麻素的含量、節約溶劑用量、縮短提取時間，而且工藝穩定、重復性良好。見表5。

表5 驗證試驗結果(n=3)

5 討論

正交試驗為一種多水平多因素的實驗設計法，特點為均勻分散、整齊可比，廣泛應用于中藥提取工藝的研究中，但其篩選因素水平和最佳參數組合僅限于實驗已設水平的組合，優選結果不會超越所取水平的范圍，有一定局限性，而這一局限可以通過人工神經網絡建模得以突破[5-7]。ANN是模擬生物神經系統對外界復雜信息處理反饋機制的數學模型，包括徑向基網絡、BP-ANN、自組織網絡、反饋網絡等，其中BP-ANN的應用最廣泛，由接受信息的輸入層、輸出信息的輸出層和中間隱含層中大量的神經元及相互連接傳遞的復雜網絡組成，具有強大的自主學習、聯想儲存能力、高效尋求優化解能力和非線性問題擬合能力，鑒于這些優勢，BP-ANN在中藥提取工藝等許多研究領域均得到了廣泛地應用[8-11]。因此，本研究將正交試驗與BP-ANN聯合應用進行熄風止動顆粒提取工藝的研究。

本研究首先通過傳統的正交試驗獲得熄風止動顆粒提取工藝的數據，然后利用正交試驗的數據作為訓練樣本數據建立BP-ANN的數學模型，再使用已建好的模型進一步優化熄風止動顆粒提取工藝，在不增加實驗工作量的基礎上獲取理想的提取工藝。研究結果顯示，正交試驗聯合BP-ANN得到熄風止動顆粒最佳提取工藝為處方量藥材加水浸1 h后，回流提取2次，第1次提取加水14.4倍量(按干藥材質量計)，第2次提取加水11倍量，每次提取75 min，不但可提高提取液中天麻素的含量，而且節約溶劑用量、縮短提取時間。

本研究中由于提取時間、提取溫度、溶劑用量等因素的單位不相同，數量級相差較大。因此，本研究在使用正交試驗的數據進行BP-ANN建模前，將正交試驗的數據進行了歸一化處理，使數據處于0～1范圍內，縮小因數量級差異造成的實驗誤差。同時，與任何一種數學模型一樣，BP-ANN也存在模型結構和函數算法等帶來的缺陷，如模型結構中隱含層的層數和每層神經元的數量不僅會影響輸出層的結果，還會延長訓練時間、出現過度擬合等問題，因此在分析處理具體數據時，應多次嘗試選擇合適的模型結構和函數算法，并結合具體實驗特點加以優化分析，建立更適合的BP-ANN模型。