超高效液相色譜法測定奧卡西平活性代謝產物的血藥濃度

宗靜，李發雙，茹毅，余紹春，雷嫣，李惠英 (昆明市兒童醫院，昆明 650034)

奧卡西平是卡馬西平的10-酮基衍生物[1]，臨床上主要用于局限性和強直-陣攣性癲癇、三叉神經痛及情感性精神障礙的治療。奧卡西平服藥后藥動學過程個體差異大，年齡、性別、聯合用藥等因素都會影響其療效及不良反應[2]，因此臨床應監測血藥濃度。

奧卡西平是前體藥物，經口服完全吸收后會迅速代謝為活性產物10，11-二氫-10羥基卡馬西平(MHD)，生物利用度約95%[3]，因此監測MHD血藥濃度具有臨床意義[4]，可有效反映奧卡西平的血藥濃度，從而指導臨床安全合理用藥和制定個體化給藥方案，減少藥物不良反應。

MHD的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等。但前者保留時間較長(6～9 min)[5-7]，目前醫療機構中需要測定MHD血藥濃度的患兒與日俱增，太長的保留時間制約了該方法的普及；后者儀器方法成本較高，操作復雜。而超高效液相色譜法避開了這些不足，不但操作簡單，而且保留時間明顯縮短，相同時間內可以測定更多患兒的血藥濃度，能夠滿足臨床需要。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters CQUITY PLC系統(Waters公司，美國)；電子天平(CP114，奧豪斯儀器)；XH-B型旋渦混合器(江蘇康健)；低溫高速冷凍離心機(Thermo公司，美國)；低速離心機(安徽中科)。

1.2 試劑

10，11-二氫-10-羥基卡馬西平對照品(美國QCC，CAS：29331-92-8，純度≥98%)；6-甲氧基水楊酸標準品(內標，麥克林，CAS：3147-64-6，純度≥98%)；小牛血清(美國，批號1751588)；乙腈(MercK公司，色譜純)；高氯酸(國藥集團化學試劑有限公司，優級純)，甲酸(天津化學試劑三廠，分析純)；實驗用水：娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 標準溶液配制

分別精密稱取MHD和內標物質各10 mg，甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得到濃度為1 mg/mL的標準溶液。

2.2 樣品處理

取200 μL血清于EP管內，加入內標6-甲氧基水楊酸20 μL，渦旋混合后加入7%高氯酸200 μL，渦旋1 min后，室溫下以轉速14 000 r/min高速離心11 min，取上清液進樣檢測。

2.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相為0.05%甲酸∶乙腈=75∶25(V/V)，檢測波長254 nm，流速0.20 mL/min，柱溫40 ℃。MHD保留時間1.81 min，內標保留時間2.68 min，二者分離好，無血清內源性物質干擾，見圖1。

2.4 標準曲線

取180 μL空白血清至EP管中，分別加入MHD標準工作液及內標工作液20 μL，渦旋混勻，制備成理論濃度為100、75、50、25、10、5 μg/mL的標準曲線血漿樣本。按“2.2項”對樣本進行處理，“2.3項”下的色譜條件進行樣本測定。MHD峰面積與內標峰面積比值(y)對濃度比值(x)繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.070 4x-0.014 3，r=0.999 9，線性范圍為5～100 μg/mL。

2.5 精密度、準確度實驗

取空白血清，分別制成100、50、10 μg/mL的高、中、低濃度的血清樣品，按“2.2項”、“2.3項”下進行處理測定，每個濃度日間測定5次，得到日內精密度，連續測定5 d，計算日間精密度，見表1。

A

表1 MHD精密度、準確度結果

2.6 回收實驗

對照樣本的制備：精密吸取160 μL小牛血清至離心管中，分別精密加入MHD標準曲線工作液20 μL、內標20 μL及水20 μL，渦旋混勻，制備成理論含MHD濃度為10 μg/mL的血漿樣本，并平行制備5個樣本。

加標樣本的制備：精密吸取160 μL小牛血清至離心管中，分別精密加入20 μL MHD標準曲線工作液、內標20 μL，共3份，再分別加入20 μL MHD標準液，制備成理論濃度為60、35、20 μg/mL的血漿樣本，每個濃度平行制備5個樣本。

按“2.2項”下處理樣本，“2.3項”下色譜條件分析，并記錄二者峰面積，計算兩者比值y，將其帶入標準曲線計算樣品濃度，并分別計算同一濃度樣本的實測濃度的平均值、標準差、以及加標回收率的平均值、標準差和相對偏差，見表2。

表2 MHD加標回收率結果

2.7 穩定性實驗

分別配制高、中、低3個濃度的血清樣品，按“2.2項”下方法處理血樣，分別置于室溫、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱，分別按“2.3項”色譜條件進樣測定，考察血清樣品在室溫、冷藏及凍融條件下MHD的穩定性，結果顯示MHD和內標在以上溫度條件下均保持穩定，見表3。

表3 MHD穩定性實驗結果

3 討論

奧卡西平與傳統抗癲癇藥物相比，具有患者耐受性好、藥物相互作用少、對肝藥酶誘導作用小等優勢，廣泛用于兒童癲癇治療[8]。但該藥治療窗較窄，藥代動力學受年齡、性別、體質量等多種因素影響，個體差異較大[9]，且患兒服用該藥后出現的不良反應時間、嚴重程度不一，因此，在兒科臨床應用中監測血藥濃度是很有必要的，不僅有利于療效評價，還可以減少不良反應，從而更安全、有效、合理用藥。

樣本前處理方法參考國內外文獻[10-11]，采用甲醇、乙腈等進行蛋白沉淀，但回收率都不甚理想，采用7%高氯酸進行蛋白沉淀，經高速離心后取上清液進樣，峰型較好、回收率較高。

本實驗內標物的選擇參考文獻[12-13]，實驗比較了甲硝唑、對氨基苯甲酸、6-甲氧基水楊酸，結果顯示甲硝唑和對氨基苯甲酸出峰時間較早，容易與血漿內源性物質峰重合，調整色譜條件也較難分開。而6-甲氧基水楊酸能與待測物分開且分離度較好，無內源性物質干擾，并且較穩定，符合內標要求。

流動相選擇參考文獻[14]，比較乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.05mL/L磷酸二氫鉀，實驗顯示甲酸-乙腈峰形較好，通過調整甲酸比例使得拖尾較小，選擇0.05%甲酸∶乙腈=75∶25作為流動相，發現其峰型較好，分離度符合標準。

MHD在240 nm和254 nm有特征吸收峰。經過實驗對比，254 nm處的信號優于240 nm，因此選擇254 nm作為本實驗檢測波長。

本課題建立了測定MHD血藥濃度的超高效液相色譜法，該方法操作簡便、穩定性較好、易于重復且經濟快捷，可以用于臨床血藥濃度的監測。