利福平致肝損害機制及基因多態性研究進展

陳智慧 綜述，劉泉波 審校 (重慶醫科大學附屬兒童醫院，兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心，兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地，兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

抗結核藥物不良反應以藥物性肝損害(drug-induced liver injury，DILI)最多見，危害性也最大[1]。研究顯示，我國涉及的主要藥物性肝損害中，抗結核藥物致肝損害(anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity，ATDH)占人群總發病率的21.99%，位居第二[2]，兒童結核患者中ATDH發病率約為8.80%[3]。ATDH可致抗結核治療選藥方案變化以及誘發耐藥，且二線抗結核藥物價格昂貴，均導致抗結核治療困難，可能引起治療中斷甚至危及生命，給個人、家庭及社會造成沉重的負擔。利福平(rifampicin，RFP)是目前抗結核治療中廣泛使用并引起ATDH的一線藥物之一，但其引起肝損害的具體機制尚不明確，本文就RFP致肝損害的機制及其基因多態性相關研究進展進行綜述。

1 利福平導致的肝損害

DILI根據發病機制分為固有型和特異質型，RFP所致ATDH多為固有型，其所致肝損害呈濃度及時間依賴性，具有可預測性[1，4]。臨床中抗結核治療以聯合用藥為主，利福平可與其他藥物相互作用，常引起肝細胞損傷型或膽汁淤積型肝損害[1，5]。RFP導致的肝臟組織病理學改變，多表現為急性肝炎、帶狀壞死及膽汁淤積性肝炎[6]，鏡下可見肝細胞脂肪變性，伴輕度壞死和炎癥，部分線粒體、內質網腫脹斷裂，以及散在的膽汁淤積[7-8]。

2 利福平致ATDH發病機制

RFP致ATDH的發病機制較復雜，具體機制尚不明確，可能有多種機制共同參與，如線粒體氧化應激、內質網應激、肝細胞凋亡增加、膽汁淤積、PXR激活誘導多種藥物代謝酶及轉運蛋白的活性和表達水平增加等。

2.1 利福平增加應激反應引起肝細胞凋亡致肝損害

RFP可通過線粒體氧化應激、內質網應激，增加肝細胞的凋亡率，降低肝細胞的存活率，其所致細胞毒性具有濃度及時間依賴性[4，9-10]。利福平可使線粒體超微結構產生病理改變引起線粒體功能障礙，導致活性氧的過度產生和細胞色素C的釋放，誘導細胞凋亡、壞死和纖維化[10]。利福平與異煙肼(isoniazid，INH)聯合用藥時，由于肝臟中谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成無法應對機體需求的增加或藥物活性代謝物的消耗性利用，導致GSH穩態失衡，引起線粒體氧化應激增加，誘導線粒體通透性改變導致肝細胞凋亡損傷[11]。GSH可與多種藥物的毒性中間代謝產物結合，并排出體外起到解毒作用[12]，GSH消耗過多可致肝臟毒性產物集聚，進一步加重肝損害。

RFP通過激活PERK-ATF4-CHOP途徑，增加葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、轉錄激活因子(activa-ting transcription factor 4，ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的蛋白和基因表達水平，從而影響內質網應激，介導細胞凋亡[9]。內質網中未折疊或錯誤折疊的蛋白質累積也可導致內質網應激，進而激活未折疊蛋白反應，誘導適應性反應以重建內質網功能并恢復體內平衡[13]，如果應激信號嚴重和/或延長，則細胞凋亡途徑被激活[14]，從而導致肝損害。

但另一方面，RFP也可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α，AMPKα)介導核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)信號通路，對肝臟起到一定程度抗氧化應激的保護作用[15]。

2.2 利福平引起肝內膽汁淤積致肝損害

多項動物實驗研究表明,RFP可引起小鼠肝內膽汁淤積。研究發現，利福平可抑制膽汁酸轉運蛋白及mRNAs的表達，如膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP，由ABCB11編碼)、Na+/?；悄懰猁}轉運蛋白(Na+/taurocholate cotransporter，NTCP，由SLC10A1編碼)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1，由ABCB1編碼)、多藥耐藥蛋白2(multidrug resistance-associated protein，MRP2，由ABCC2編碼)、有機陰離子轉運多肽2(organic anion transporting protein 2，OATP2，由SLCO1B1編碼)、有機溶質轉運蛋白β(organic solute transporter β，OSTβ)。這些因子影響膽汁酸循環，血清中結合膽紅素、總膽汁酸的水平顯著升高，導致膽汁淤積及肝功能損害[4，12，16-18]，但具體發生機制仍待進一步研究。Xu B Y等[19]研究發現，RFP可通過氧化應激激活蛋白激酶C-細胞外信號調節激酶/c-Jun氨基末端激酶/p38(protein kinase C-extracellular signal-regulated kinase/c-Jun N-terminal kinase/p38，PKC-ERK/JNK/p38)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)信號通路，引起網格蛋白介導的內吞作用和泛素-蛋白酶體降解MRP2，使MRP2在細胞膜的分布減少，抑制MRP2表達，導致膽汁淤積。熊去氧膽酸和丹參酮ⅡA通過Nrf2介導適應性應答，增加膽汁酸轉運蛋白表達則能減輕肝損害[4，20]。RFP還可影響緊密連接蛋白如ZO-1蛋白和閉合蛋白的連續性，破壞肝細胞連接，誘導肝內膽汁淤積[7]。肝功能受損后肝臟中有毒膽汁鹽逐漸積累，激活GRP78和CHOP等蛋白的基因表達，促進未折疊蛋白反應[21]，增加肝細胞凋亡。

2.3 利福平通過人孕烷X受體途徑引起肝毒性物質積聚致肝損害

RFP為人孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)特異性配體，可引起PXR蛋白過表達和活化，誘導多種藥物代謝酶及轉運蛋白的活性和表達水平增加[25]，可增加RFP自身及其他藥物代謝，并使卟啉、脂質及膽紅素等物質在機體內積聚導致肝損害。

原卟啉IX(protoporphyrin IX，PPIX)是卟啉生物合成的中間體，通常在肝臟中濃度非常低，肝臟中高濃度的PPIX會導致肝損傷。RFP與INH聯用時通過PXR介導改變血紅素生物合成途徑，導致肝臟中內源性肝毒素PPIX積聚并致毒性作用[26]。而氨基乙酰丙酸合成酶(aminolevulinic acid synthase，ALAS)是卟啉生物合成中的限速酶，PXR的激活可上調肝臟中的ALAS1表達[27]，使其產物ALA增加，ALA是PPIX的前體，進而引起PPIX積聚導致肝損害。

過氧化物酶體增殖體激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ)信號通路是PXR的一個下游靶點，RFP通過活化PXR誘導PPARγ信號通路及其靶基因表達上調，促使循環系統的甘油三酯轉向肝臟；另外脂肪酸合成的相關mRNA(Fas、Acc、Scd-1)表達上調，促進脂肪合成，加劇脂質在肝臟的積聚[28]。表達上調的PPARγ信號通路下游可檢測到圍脂滴蛋白，該蛋白可促進脂滴成熟并抑制脂肪的分解，導致甘油三酯聚集，但該傳導途徑未表現出劑量依賴性，引起的脂質積聚主要是低劑量RFP的毒性作用[29]。在另一項動物實驗研究中，高劑量RFP(>20 mg/kg)可通過間接激活mPXR的核轉位，誘導CYP3A11等PXR靶基因的反式激活，增加CYP3A在小鼠肝臟中的表達，而CYP3A高表達可能會引起總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇升高[29-30]。

PXR蛋白過表達和活化也增加CYP3A4和CYP2B6表達，促進INH產生肝毒性代謝產物[25，31]，熊果酸和齊墩果酸通過抑制PXR的反式激活作用，降低其表達則可減輕肝損害[32-33]。對于合并有艾滋病的結核患者，PXR還可通過CYP3A4依賴性途徑參與利托那韋生物活化、氧化應激和內質網應激導致肝毒性[34]。由于膽紅素的清除需要表達尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase，UGT)，RFP引起的高膽紅素血癥可能與PXR對UGT1A表達的負調節作用有關[29]。

2.4 其他

在以往KEGG通路富集分析中，PPARγ信號通路、CYP參與的異生素代謝、GSH代謝、化學致癌作用和酒精毒性作用相關蛋白表達在RFP處理后的動物肝臟中呈劑量依賴性增加[29]，對肝臟功能均產生一定影響。

3 利福平致ATDH相關基因多態性

在中國人群發現，ABCB11基因的rs2287616位點與抗結核藥物誘導的膽汁淤積型肝損害有關[17]；OATP1B1的521T>C位點與利福平所致的肝損害尤其是膽汁淤積型肝損害密切相關[35]；SLCO1B1基因的rs4149014位點、SLCO1B1*15單倍體[36]，SLCO1B1基因的rs2417957位點T/T基因型、rs4149063位點T/T基因型和TGTG、TTTC和GTTC單倍型[37]，以及Nrf2基因中rs4243387位點T/C基因型或rs2001350、rs6726395位點單倍型C-C[38]也與ATDH風險增加相關。轉錄因子BTB-CNC異體同源體(BTB domain and CNC homologue 1，Bach1)可與Nrf2競爭結合DNA，中國人群中Bach1的遺傳多態性也可能與ATDH易感性有關[39]，日本人群中Bach1基因rs2070401位點C/C基因型更是發生ATDH的獨立危險因素[40]。

PXR基因在中國人群中的rs2461823-AA基因型[41]和印尼人群中的rs3814055-TT基因型[42]與ATDH風險增加相關，而PXR基因的rs7643645-AA基因型[41]、rs3814055變異型[43]、次要等位基因rs7643645和H0010001單倍型[44]與ATDH風險降低有關。巴西人群中CYP2B6基因的rs3745274位點516TT純合子變異型與RFP-INH導致的ATDH有關[31]，中國人群中攜帶有CYP2B6*6/*6的男性患者發生ATDH風險也更高[45]。Huai C等[46]通過全基因組關聯分析及CRISPR/cas9介導的甲基化修飾細胞模型，證明AK2、SLC8A2和PSTPIP2基因區域或其附近的4個CpG位點與利福平治療后的細胞應答反應有關，并參與引起肝損害。

4 結語

ATDH是全球嚴重的藥物不良反應，可影響抗結核治療療效。近年國內外大量研究發現了ATDH的一些高危因素及易感基因，但由于ATDH機制的復雜性以及相關基因的多態性，不同抗結核藥物單獨或相互作用導致肝損害的機制尚不完全清楚，了解ATDH發生機制有助于我們提前預測和識別抗結核藥物與ATDH的相關性及嚴重程度，減少肝損害的發生，為結核患者的個體化及精準治療提供理論基礎。但目前研究發現的易感基因包含SNP位點較少，也缺乏多種族、多中心的大樣本研究，尚不能作為獨立的分子生物標志物指導臨床抗結核治療，未來全基因組關聯分析將更多的應用于結核病研究，逐漸展開更深入的分子遺傳機制研究。