響應面法優化美國靈芝姬松茸復合酸奶加工工藝*

王 鑫，成學冰，魏玉凱，王佳燕，李 碩，韓都柱，王 鑫，王琳琳*

（河北農業大學理工學院，河北 黃驊 061100）

美國靈芝中的靈芝多糖具有免疫調節[1]、降低血糖[2]、抗氧化[3]和解酒護肝[4-6]作用。姬松茸含有人體所需的8種必需氨基酸以及多種維生素，可以調節人體免疫功能[7-8]、改善學習記憶力、促進人骨髓造血功能以及抗疲勞[9]、抗腫瘤[10-11]等生物功效。

酸奶是一種由乳酸菌經發酵而成的乳制品，具有獨特風味。隨著生活水平的提高，人們更加注重食品營養問題[12]?，F在市場上普遍存在的是原味酸奶和水果酸奶，其中，水果酸奶在一定程度上提高了酸奶的營養價值，增強了一定的口味。但食用菌酸奶很少涉足，本次實驗主要采用美國靈芝和姬松茸的液態培養物和菌絲球為原料，采用單因素試驗和響應面試驗對其加工工藝進行優化，研究一款新型食用菌酸奶。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

美國靈芝、姬松茸由本實驗室提供；嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus）與保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)選自川秀乳酸菌酸奶發酵粉；奶源采用伊利利樂包純牛奶。

1.1.2 試驗儀器

SW-CJ-1FB無菌操作臺，杭州川一實驗儀器有限公司；SPX-250B-D振蕩培養箱，上海博遠實業有限公司；BAS224S電子天平，賽多利斯科技有限公司；DL-6M冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 美國靈芝、姬松茸復合酸奶加工工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 美國靈芝、姬松茸菌絲制備

（1）液態PDA培養基制備：將土豆去皮切條，稱取200 g土豆條放入鍋中，加入1 000 mL水，加熱煮沸25 min，用四層紗布趁熱過濾，取濾液，定容至1 000 mL。輕微加熱，加入20 g白砂糖，攪拌，待完全溶解后補充水分至1 000 mL。趁熱將其分裝到250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，用封口膜將三角瓶封好，于滅菌鍋中121℃滅菌20 min[13]。冷卻備用。

（2）美國靈芝、姬松茸菌絲培養：在已培養好的美國靈芝和姬松茸平板上，切取邊長為1 cm的正方形小塊若干，每瓶液態PDA培養基接種三塊，美國靈芝、姬松茸各接種5瓶。置于160 r/min搖床培養6 d，獲得美國靈芝菌絲發酵液、姬松茸菌絲發酵液。

（3）美國靈芝、姬松茸菌絲發酵液制備：將1.2.2.1（2）中獲得的美國靈芝菌絲發酵液、姬松茸發酵液置于組織搗碎機中搗碎，得到美國靈芝勻漿菌絲發酵液、姬松茸勻漿菌絲發酵液。

1.2.2.2 酸奶制備

（1）調配、滅菌：將新鮮牛奶放入鍋中加熱，隨后加入7%白砂糖。均質，于60℃加熱30 min滅菌。

（2）冷卻、接種：a.待溫度冷卻至 40～45 ℃時加入川秀乳酸菌發酵劑，按照每750 mL牛奶加入1 g發酵劑。充分混勻后，分裝到150 mL酸奶瓶中，每瓶裝入130 mL。b.并按照試驗設計比例分別添加美國靈芝勻漿菌絲發酵液、姬松茸勻漿菌絲發酵液。

（3）保溫發酵：將接種后的酸奶瓶按照試驗設計溫度時間放入培養箱中進行發酵。

（4）冷卻、后熟：待發酵好的酸奶稍冷卻后放入4℃冰箱內再發酵12 h[14]，即得酸奶成品。

1.2.3 單因素試驗設計

1.2.3.1 美國靈芝、姬松茸比例的確定

以美國靈芝、姬松茸總添加量為5%，將美國靈芝、姬松茸的比例按照 1∶2、1∶1、2∶1 分別加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃發酵7 h，對成品進行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.2 美國靈芝、姬松茸總添加量的確定

以美國靈芝、姬松茸比例為1∶1，將美國靈芝、姬松茸總添加量按照3%、5%、8%分別加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃發酵7 h，對成品進行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.3 發酵溫度的確定

以美國靈芝、姬松茸比例為1∶1和總添加量為5%加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，分別于39℃、41℃、43℃和45℃培養7 h，對成品進行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.4 發酵時間的確定

以美國靈芝、姬松茸比例為1∶1和總添加量為5%加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃分別培養5 h、6 h、7 h和8 h，對成品進行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.5 統計學分析

試驗設3次重復，數據采用平均值±標準差表示方法，顯著性差異采用Duncan多重比較法進行比較[15]。

1.2.4 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果確定四因素三水平試驗，以感官評定、持水力和酸度為綜合依據進行優化，因素水平設計如表1所示。

表1 Box-Beheken設計因素水平及水平編碼

1.3 評價指標

1.3.1 感官評定

參考屈茹琪[16]感官評定標準，采用評分分析法對美國靈芝、姬松茸復合酸奶的乳清析出情況、組織狀態、風味和滋味進行評定，評分為百分制，由10名受過專業培訓的學生組成評定小組，按照表2的評定標準進行評定，結果去除最高分和最低分，剩余分數取平均值，試驗結果保留兩位小數，即得到產品最終的感官評定分數。

表2 美國靈芝姬松茸復合酸奶的感官評定標準

1.3.2 持水力

持水力反應蛋白凝膠網絡對水的保持能力，持水力越高，酸奶質地越好，不易發生蛋白析出[17]。

參考李海平等[17]持水力測定方法，持水力的測定方法如下：

取20 g酸奶樣品于離心管中，以3 500 r/min速度離心30 min，去上清液稱取沉淀物質質量。持水力公式如下：

式中：AW為持水力，%；m1為離心后沉淀物總質量；m2為樣品總質量。

1.3.3 酸度

酸奶酸度可以保證酸奶產品的風味、口感、粘稠度等，一般情況下酸度在60～100°T的酸奶口感較好，國家標準中對酸奶酸度的要求是≥70°T[12,18]。

參照GB 5009.239-2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》進行酸度滴定[18]，酸奶酸度的測定方法如下：

（1）氫氧化鈉溶液的標定。準確稱取0.40～0.50g基準試劑鄰苯二甲酸氫鉀三份，置于錐形瓶中標號，加20～30 mL蒸餾水溶解后，加一滴酚酞指示劑。用配置好的氫氧化鈉溶液分別滴定至溶液呈紅色，30s內不褪色。記錄每次消耗的氫氧化鈉溶液的體積數。

式中：C為氫氧化鈉標準溶液的濃度；m1為基準試劑鄰苯二甲酸氫鉀的質量；V1為滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積；204.22：鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質量。

（2）酸度測定。稱取10 g樣品，置于150 mL錐形瓶中。加20 mL蒸餾水，混勻。再加2.0 mL酚酞溶液，混勻。用氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，并在30 s內不褪色。記錄消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積數，重復三次。

式中：X為式樣的酸度，單位為度；C2為氫氧化鈉標準溶液的摩爾濃度；V2為滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積；m2為試樣質量；0.1為酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 美國靈芝、姬松茸添加比例對酸奶質量影響

通過表3分析得出，菌比例為1∶1時，酸奶質量較高。菌比例為1∶1時，感官評分最高，此時，酸奶外觀細膩，無乳清析出且口感較好無異味；同時菌比例為1∶1時，持水力明顯高于其它兩組；菌比例為1∶1時，酸度在國家標準規定范圍內高于其它兩組。因此，綜合感官評分、持水力、酸度，選擇美國靈芝：姬松茸＝1∶1為最佳菌比例較為合適。

表3 菌比例對持水力、酸度以及感官評定的影響

2.1.2 美國靈芝、姬松茸總添加量對酸奶質量影響

通過表4分析得出，美國靈芝、姬松茸總添加量為5%時，酸奶質量較高，感官評分也最高，為85.26左右，在3%和8%時感官評分處于同一水平面，均低于總添加量5%條件下感官評分；菌種總添加量為3%、5%時持水力處于同一水平面，優于8%時的持水力；酸度在3%、5%條件下處于同一水平面。因此，綜合感官評分、持水力、酸度，選擇總添加量為5%較為合適。

表4 總添加量對持水力、酸度以及感官評定的影響

2.1.3 發酵溫度對酸奶質量的影響

通過表5分析得出，發酵溫度為43℃時，酸奶質量較高。在39℃下，感官評定得分小于其他三組且其它三組處于同一水平面并無明顯區別；持水力在39℃、41℃、43℃和45℃四個溫度變化下仍處于同一水平面；在41℃下酸度較其它三個溫度下較低，45℃最高，但是考慮到實際工業生產中節約能源、降低成本的需求和原則且綜合感官評分、持水力、酸度，選擇發酵溫度為43℃較為合適。

表5 發酵溫度對持水力、酸度以及感官評定的影響

2.1.4 發酵時間對酸奶質量的影響

通過表6分析得出，發酵時間為7 h時，酸奶質量較高。感官評定得分在7 h和8 h達到最高，處于同一水平面且高于其他兩組；在四種發酵時間下，持水力處于同一水平面；5 h下酸度最低，且一般情況下酸度在60～100°T的酸奶口感較好，國家標準中對酸奶酸度的要求是≥70°T[12]。8 h條件時超出范圍，故排除。因此，綜合感官評分、持水力、酸度，選擇發酵時間7 h較為合適。

表6 發酵時間對持水力、酸度以及感官評定的影響

綜上所述，美國靈芝姬松茸復合酸奶在加工過程中選擇的最佳加工條件為：菌比例（美國靈芝：姬松茸）=1∶1、菌種總添加量5%、發酵溫度43℃、發酵時間7 h。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面優化試驗對感官評定的影響

2.2.1.1 響應面優化試驗設計與感官評定結果

根據單因素試驗結果，確定菌比例、總添加量、發酵時間、發酵溫度為試驗因素。根據Box-Beheken試驗設計水平方案（表1），采用四因素三水平響應面分析，結果見表7。

表7 響應面優化試驗設計對感官評定結果

2.2.1.2 感官模型檢驗

采用Design-Expert 12軟件對于表進行多項擬合回歸，得到感官評定Y1與A菌比例、B菌總添加量、C發酵溫度、D發酵時間的二元多次回歸模型為Y1=91.04+4.66A+0.3560B+1.03C-2.53D-0.2914AB+0.0126AC-3.83AD-0.0347BC+3.20BD-0.5375CD-7.07A2-3.58B2-2.47C2-1.56D2

Box-Beheken試驗結果方差分析見表8。

由表8可知交互項（AD、BD）對酸奶感官評分較為顯著，且模型顯著，說明其與實際情況具有較高的吻合度，失擬項差異不顯著，說明方程可以更好的用于美國靈芝姬松茸復合酸奶工藝的優化。

表8 感官評定Box-Beheken試驗結果方差分析

為驗證方差分析結果，對交互項（AD、BD）顯著的曲面圖和等高線圖進行分析，曲面的陡峭程度反映對感官評分的影響程度，越陡，說明影響越大；而等高線反映了各因素交互作用的大小，橢圓表示作用顯著[19]。結果如圖1～圖2所示。

圖1 菌比例和發酵時間交互影響感官評分的曲面圖和等高線

圖2 總添加量和發酵時間交互影響感官評定的曲面圖和等高線

由圖1和圖2分析可知，根據感官評定得出的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝：姬松茸）=226：200、菌種總添加量為4.779%、發酵溫度為42.998℃、發酵時間為7.358 h，此時預測感官評分為89.742。

2.2.2 響應面優化試驗對持水力的影響

2.2.2.1 響應面優化試驗設計與持水力結果

根據單因素試驗結果，確定菌比例、總添加量、發酵時間、發酵溫度為試驗因素。根據Box-Beheken試驗設計水平方案（表1），采用四因素三水平響應面分析，結果見表9。

表9 響應面優化試驗設計對持水力結果

2.2.2.2 持水力模型檢驗

采用Design-Expert 12軟件對于表進行多項擬合回歸，得到持水力Y2與A菌比例、B菌總添加量、C發酵溫度、D發酵時間的二元多次回歸模型為

Box-Beheken試驗結果方差分析見表10。

表10 持水力Box-Beheken試驗結果方差分析

由表10可知交互項（AC）對酸奶持水力較為顯著，且模型顯著，說明其與實際情況具有較高的吻合度，失擬項差異不顯著，說明方程可以更好地用于美國靈芝姬松茸復合酸奶工藝的優化。

為驗證方差分析結果，對交互項（AC）顯著的曲面圖和等高線圖進行分析，曲面的陡峭程度反映了對持水力的影響程度，越陡，說明影響越大；而等高線反映了各因素交互作用的大小，橢圓形表示作用顯著[19]。結果如圖3所示。

圖3 菌比例和發酵溫度交互影響持水力的曲面圖和等高線

由圖3分析可知，根據持水力得出的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝：姬松茸）=229∶200、菌種總添加量為 5.197%、發酵溫度為43.077℃、發酵時間為6.732 h，此時預測持水力為0.880。

2.2.3 響應面優化試驗對酸度的影響

2.2.3.1 響應面優化試驗設計與酸度結果

根據單因素試驗結果，確定菌比例、總添加量、發酵時間、發酵溫度為試驗因素。根據Box-Beheken試驗設計水平方案（表1），采用四因素三水平響應面分析，結果見表11。

表11 響應面優化試驗設計對酸度結果

2.2.3.2 酸度模型檢驗

采用Design-Expert 12軟件對于表進行多項擬合回歸，得到酸度Y3與A菌比例、B菌總添加量、C發酵溫度、D發酵時間的二元多次回歸模型為Y3=94.92+3.50A+0.3722B-1.03C+3.41D+0.7769AB-0.8664AC+3.42AD+0.5462BC-0.2859BD-2.05CD-7.29A2-5.27B2-0.1911C2-0.3855D2

Box-Beheken試驗結果方差分析見表12。

表12 酸度Box-Beheken試驗結果方差分析

由表12可知交互項 （AD）對酸奶酸度較為顯著，且模型顯著，說明其與實際情況具有較高的吻合度，失擬項差異不顯著，說明方程可以更好地用于美國靈芝姬松茸復合酸奶工藝的優化。

為驗證方差分析結果，對交互項（AD）顯著的曲面圖和等高線圖進行分析，曲面的陡峭程度反映對酸度的影響程度，越陡，說明影響越大；而等高線反映了各因素交互作用的大小，橢圓表示作用顯著[19]。結果如圖4所示。

圖4 菌比例和發酵時間交互影響酸度的曲面圖和等高線

由圖4分析可知，根據酸度得出的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例 （美國靈芝：姬松茸）=329：250、菌種總添加量為 5.405%、發酵溫度為42.706℃、發酵時間為6.617 h。此時預測酸度為93.02。

2.2.4 結果綜合分析

根據感官評定優化試驗得出的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=226∶200、菌種總添加量為 4.779%、發酵溫度為42.998℃、發酵時間為7.358 h；根據持水力優化試驗得出的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=229∶200、菌種總添加量為5.197%、發酵溫度為43.077℃、發酵時間為6.732 h；根據酸度優化試驗得出的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=329：250、菌種總添加量為5.405%、發酵溫度為42.706℃、發酵時間為6.617 h。為了試驗的可操作性，將美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝調整為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=1∶1、菌種總添加量為5%、發酵溫度為43℃、發酵時間為7 h。

2.3 驗證試驗

根據響應面試驗結果，將美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝調整為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=1∶1、菌種總添加量為5%、發酵溫度為43℃、發酵時間為7 h。預測美國靈芝姬松茸復合酸奶的感官評分為89.742、持水力為0.880、酸度為93.020。進行三次重復試驗，得到的最終感官評定為90.275、持水力為0.8762、酸度為95.5944，與預測值接近，說明響應面法優化得到的美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝是合理的。

2.4 成品比較

最終，我們按照最佳加工工藝制作成品美國靈芝姬松茸復合酸奶及其空白對照酸奶。采用CAT試劑盒對其蛋白質含量進行測定，測定美國靈芝姬松茸復合酸奶CAT活力為18.652 U/mg prot，空白對照酸奶CAT活力為0.8814 U/mg prot。結果表明：隨著美國靈芝、姬松茸菌絲的加入，對酸奶蛋白質含量有著顯著提高。

3 結論

通過單因素試驗和響應面優化試驗表明，美國靈芝姬松茸復合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=1∶1、菌種總添加量為 5%、發酵溫度為43℃、發酵時間為7 h。在此工藝條件下美國靈芝姬松茸復合酸奶外觀細膩，風味醇厚，無乳清析出。同時，持水力較高，蛋白凝膠網絡對水的保持能力強。美國靈芝姬松茸復合酸奶憑借其獨特的風味和較高的蛋白質含量有著良好的市場前景。