響應面法優化藜麥發酵飲料配方的研究

陸 陽

（中央儲備糧通遼東郊直屬庫有限公司，內蒙古 通遼 028012）

藜麥是藜科的一種植物，已經有近7 000年的種植歷史[1-2]，它具有特殊的營養特性，并含有高濃度的蛋白質、必需氨基酸和不飽和脂肪酸，特別是賴氨酸和蛋氨酸含量最高[3-5]，它還含有多種維生素，礦物質和其它有益化合物，該作物被認為是最好的植物蛋白來源之一。此外，藜麥中還含有皂苷、多酚、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、黃酮等多種功能性成分，同時含有豐富的膳食纖維，食用后使人產生飽腹感，非常適合糖尿病人群長期食用[6-9]。研究表明，長期食用藜麥可以有效地緩解高血壓、高血糖、心臟病等，還具有增強人體免疫力、補充營養及減肥等功效。本文以藜麥為發酵原料接種乳酸菌研制藜麥發酵飲料，為藜麥產品開發進行了研究探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藜麥，吉林省中谷藜麥實業有限公司提供；蔗糖、檸檬酸、黃原膠均為食品級；試驗菌種，乳酸菌購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；MRS培養基，青島海博生物技術有限公司；GABA標準品（純度≥98%），北京索萊寶科技有限責任公司；鄰苯二甲醛，上海笛柏有限公司；乙腈，上海笛柏有限公司；2-巰基乙醇，上海笛柏有限公司；四氫呋喃，上海笛柏有限公司；MRS培養基，青島海博生物技術有限公司；乙酸鈉，天津歐博凱化工有限公司；碳酸鈣，天津歐博凱化工有限公司；硼酸、無水乙醇、甲醇均為國產分析純。

1.2 試驗儀器

FA1204B電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；BL-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；SW-CJ-2FD型凈化工作臺：上海新苗醫療器械制造有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司；Sigma3K15型高速離心機，北京五洲東方科技發展有限公司；SHP-250型生化培養箱，上海精宏試驗設備有限公司；FW100型萬能粉碎機，瑞安市永歷制藥機械有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；SHZ-D（III）循環水式真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；D-30M型高壓均質機，美國Phd科技公司；高效液相色譜儀Waters2695，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥發酵飲料加工工藝

藜麥→挑選→粉碎→加水→放入搖床→接種乳酸菌→發酵→離心→過濾 （無菌）→濃縮→發酵原液→調配→均質→灌裝密封→殺菌→冷卻→成品

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 藜麥粉的制備

挑選籽粒完整、無蟲蝕的藜麥進行粉碎，過80目標準篩，收集過篩后的樣品備用。

1.3.2.2 菌種活化

用無菌移液槍吸取200 μL液體培養基，滴入菌種保藏管內，使其呈懸浮狀態，然后將乳酸菌菌液接種在MRS培養基中平板涂布，在37℃下培養48h后，將培養基于9 000 r/min的高速冷凍離心機中離心10 min，制得菌泥，并用無菌水來重新溶解調整菌液濃度在108CFU/mL作為發酵劑。

1.3.2.3 發酵液制備

參考先前研究的發酵液制備方法[10]，準確稱取25 g粉碎好的藜麥粉，加入滅菌處理后的去離子水150 mL，放置于發酵罐內，接入4%乳酸菌，發酵溫度34℃，搖床轉速140 r/min，發酵24 h，將發酵液放入5 000 r/min的離心機內離心15 min，發酵液進行過濾、濃縮，得到藜麥發酵液。

1.3.2.4 調配、均質、灌裝、殺菌

將上述原輔料按優化實驗所得的最佳比例進行調配，在30 MPa的條件下均質兩次，于100 mL的玻璃瓶進行灌裝，95℃殺菌15 min。

1.3.3 液相色譜法測γ-氨基丁酸含量

1.3.3.1 發酵飲料預處理

將發酵飲料放入8 000 r/min的離心機內離心15 min，上清液進行旋轉蒸發器進行濃縮，過0.45 μm濾膜，超聲波除泡10 min備用。

1.3.3.2 標準溶液的制備

按參考文獻[11]的方法進行標準溶液配制，準確稱取0.1 g γ-氨基丁酸標準品，用蒸餾水溶解并定容到100 mL,過0.45 μm濾膜，用超聲波除泡10 min備用。

1.3.3.3 OPA衍生液制備

稱取0.1 g鄰苯二甲醛（OPA），用1 mL乙腈溶解，然后加入130 μL巰基乙醇最后用 0.4 mol/L的硼酸緩沖液定容到10 mL備用。

1.3.3.4 衍生化反應

取預處理好的樣品20 μL，加入100 μL OPA衍生液，震蕩5 s后靜置3 min，進樣20 μL。

1.3.3.5 色譜分析條件

色譜柱：Kromasil-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：流動相A為乙酸鈉溶液加三乙胺用5%醋酸調pH 7.2±0.02，最后加入四氫呋喃混合后過濾備用；流動相B為乙酸鈉溶液用5%醋酸調pH 7.2±0.02，再添加乙腈和甲醇使其三者比例為 1：2：2（體積比），混合后過濾膜備用。設置液相色譜流動相流速為1 mL/min,洗脫程序方法按表1進行，柱溫 40 ℃，檢測波長 338 nm[12～14]。

表1 梯度洗脫程序參數表

1.3.4 藜麥發酵飲料配方單因素實驗

選取蔗糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、檸檬酸添加量 （0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、黃原膠添加量 （0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、發酵液添加量（10%、30%、50%、70%、90%），四個因素不同水平進行單因素試驗，以感官評分為指標，研究藜麥發酵飲料單因素最佳配方。

1.3.5 藜麥發酵飲料配方響應面優化實驗

在單因素試驗的基礎上，選取蔗糖、檸檬酸、黃原膠、發酵液添加量4個因素，以感官評分作為實驗設計的響應值，根據Box-Benhnken利用四因素三水平的實驗設計優化藜麥發酵飲料配方[15-16]。響應面設計實驗因素及水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計表

1.3.6 藜麥發酵飲料理化指標及微生物指標測定

1.3.6.1 理化指標測定

酒精度測定參照GB/T 394.2-2008對藜麥發酵飲料進行酒精度的測定。

pH測定參照GB/T 5009.237-2016對藜麥發酵飲料進行pH值的測定。

1.3.6.2 微生物指標測定

藜麥發酵飲料菌落總數檢測參照GB/T 4789.2-2016對藜麥發酵液進行菌落總數測定。

藜麥發酵飲料大腸菌群檢測參照GB/T 4789.3-2016對藜麥發酵液進行大腸菌群測定。

藜麥發酵飲料致病菌檢測參照GB/T 4789.4-2016進行沙門氏菌檢驗、GB/T 4789.10-2016進行金黃色葡萄球菌檢驗、GB/T 4789.15-2016進行霉菌檢驗和酵母計數。

1.3.7 感官評定

請10位專業的食品感官評價人員對藜麥發酵飲料進行專業的食品感官評定，感官指標包括藜麥發酵飲料的色澤、口感、氣味及組織狀態（是否有明顯雜質），評價滿分設定為100分，按照評分標準進行評分。評分標準見表3。

表3 藜麥發酵飲料感官評分標準

1.3.8 數據處理

本文所使用的圖片均采用Origin 7.5制得，結果采用SPSS22.0軟件對兩組數據間進行方差分析：p＜0.01表示差異極顯著，p＜0.05表示差異顯著，數據具有統計學意義。使用Design-Expert 8.0軟件進行響應面試驗設計、優化和分析，每組試驗均做了三組平行試驗。

2 結果與分析

2.1 藜麥發酵飲料配方單因素結果分析

2.1.1 蔗糖添加量對感官評分的影響

蔗糖添加量單因素實驗結果見圖1，蔗糖添加太少不足以中合發酵飲料中的酸味，從而影響口感。但蔗糖添加量過多則會影響藜麥發酵后飲料獨特的酸味，選擇蔗糖添加量為5%左右為宜。

圖1 蔗糖添加量對感官評分的影響

2.1.2 檸檬酸添加量對感官評分的影響

檸檬酸添加量單因素實驗結果見圖2，由圖2可知藜麥經發酵后所產生的酸味比較單一，適當地添加檸檬酸會增強成品的風味，添加太少風味較差，添加太多則會影響發酵后所產生的獨特酸味，從而影響口感。選擇檸檬酸添加量為0.03%左右為宜。

圖2 檸檬酸添加量對感官評分的影響

2.1.3 黃原膠添加量對感官評分的影響

黃原膠添加量單因素實驗結果見圖3，由圖3可知黃原膠添加太多，飲用時產品過于粘稠，口感會差，黃原膠添加過少，成品口感不細膩且不穩定。選擇黃原膠添加量為0.15%左右為宜。

圖3 黃原膠添加量對感官評分的影響

2.1.4 發酵液添加量對感官評分的影響

發酵液添加量單因素實驗結果見圖4，由圖4可知由于藜麥發酵后口感獨特，添加量太多，飲用時產品中藜麥的風味太濃，口感較差。添加太少又不具藜麥發酵后的獨特風味，選擇發酵液添加量為50%左右為宜。

圖4 發酵液添加量對感官評分的影響

2.2 響應面優化藜麥發酵飲料配方結果分析

2.2.1 響應面設計及試驗結果

響應面設計及試驗結果見表4。

表4 響應面優化試驗結果

2.2.2 回歸模型方差分析結果

對實驗結果進行回歸分析，并對各因素回歸擬合后得到如下回歸方程：Y=92.80+2.67A-1.92B-1.17C-1.08D+0.50AB+0.75AC+3.25AD-0.50BC+0.25BD+0.25CD-5.15A2-7.02B2-2.40C2-3.03D2

對此回歸模型進行方差分析，結果見表5。由表5可得出回歸模型R2=0.9736，由方差分析可知回歸模型的p值＜0.01，說明此回歸方程模型差異極顯著，模型實際值與預測值擬合較好。失擬項p=0.2535＞0.05，不顯著，試驗誤差較小。四個因素中蔗糖、檸檬酸、黃原膠及發酵液添加量為極顯著，由F值可知各因素對感官評分影響的強弱為發酵液添加量＞檸檬酸添加量＞蔗糖添加量＞黃原膠添加量。

經Design-expert軟件對回歸方程的分析，得到藜麥發酵飲料最佳配方為：蔗糖添加量5.33%，檸檬酸添加量0.032%，黃原膠添加量0.14%，蔗糖添加量5%，發酵液添加量50.16%，考慮到實際可行性調整為蔗糖添加量5%，檸檬酸添加量0.03%，黃原膠添加量0.15%，發酵液添加量50%，此時產品感官評分為93，與預測值相接近，表明此配方具有可行性。

2.3 γ-氨基丁酸發酵飲料色譜圖及標準曲線

采用液相色譜法對GABA（γ-氨基丁酸）進行分析，圖5為GABA標準品的色譜圖。從圖5中我們可以看出，GABA的保留時間為5.8 min左右，標準品色譜圖中目標峰分離效果好，峰型對稱。圖6為發酵飲料色譜圖，GABA的保留時間為5.7 min左右，圖中可以看出GABA發酵飲料中可檢測物質種類較多，但是GABA與各物質可以清晰、有效地分離并且峰型較好。說明該高效液相方法可以用于GABA檢測并計算其含量。

圖5 GABA標準品色譜圖

圖6 發酵飲料的色譜圖

標準曲線是以GABA標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標所繪制的，如圖7所示。由圖7得到回歸方程為Y=8853X-3.2011，線性相關系數R2=0.9998，當 GABA 濃度在（0.005～0.1）mg/mL 范圍內線性良好，經計算發酵飲料中GABA含量為0.625 mg/mL

圖7 GABA標準曲線

表5 回歸模型及方差分析

2.4 藜麥發酵飲料感官評定及衛生學指標測定

2.4.1 藜麥發酵飲料衛生學檢測指標

按照國家標準對藜麥發酵液中菌落總數和大腸菌群進行檢測，檢測結果如表6所示。

表6表明本試驗制得的藜麥發酵飲料的清潔狀態較好，符合國家衛生標準，可以放心飲用。

2.4.2 藜麥發酵飲料理化指標

按照國家標準，藜麥發酵飲料pH和酒精度檢測結果如表7所示。

表6 藜麥發酵液中菌落總數和大腸菌群的含量

表7 藜麥發酵飲料pH和酒精度檢測結果

2.4.3 藜麥發酵飲料感官評定

本試驗所研制的藜麥發酵飲料經過10名專業食品感官評價人員的感官評定，評分結果表明本試驗制得的藜麥發酵飲料口感較好，可被大眾接受。

3 結論及展望

本試驗利用響應面法對藜麥發酵飲料配方進行優化，得到最佳配方為蔗糖添加量5%，檸檬酸添加量0.03%，黃原膠添加量0.15%，發酵液添加量50%。此條件下測得成品中GABA含量為0.625mg/mL，該產品口感酸甜適中，既有藜麥和乳酸菌發酵后獨特的風味，也有一定功能性，試驗為藜麥產品的開發奠定了基礎，具有一定的應用前景和實際意義。

藜麥經過發酵后，會產生許多發酵殘渣，這些殘渣中也含有很多營養物質。如果直接將這些殘渣丟棄，會造成很大的資源浪費，為了避免這種資源浪費，可將其用于藜麥餅干、代餐粉等產品開發，以期達到合理利用藜麥資源并創造更大經濟效益目的。