黑果腺肋花楸多酚對抑郁癥小鼠腸道菌群及 大腦BDNF水平作用機理的探討

嵇威，盛桂華，陳炫宏，董雷超，南希駿，張軍，周泉城*

（1.山東理工大學農業工程與食品科學學院食品科學系，農產品功能化技術山東省高校重點實驗室，山東淄博 255049）（2.淄博市城鄉規劃發展中心，山東淄博 255000）

抑郁癥是一種表現為長期、持續的情緒消極，興趣缺乏的情感障礙[1]。隨著人們受到的壓力增大，抑郁癥的患病率也在持續攀升，據世衛組織數據統計，預計至2030年，抑郁癥總病例數或將超越各類心血管疾病的患者數量總和[2]。尚未有研究與理論可充分清晰的闡明抑郁癥的發病原理，目前被廣泛認可的理論是單胺學說[3]。該學說認為由于神經遞質例如5-羥色胺與去甲腎上腺素等的水平降低而引起抑郁，據此研發提高兩者水平的抑郁調節藥物，但此類藥物僅僅有益于部分患者，并且患者可能出現耐藥性等反應[4]。因此，通過食品中營養物質干預調節抑郁癥，并開發高效、對人體無毒害與副作用的抑郁調節營養體系成為了人們關注的重點。近年來，研究發現許多食品例如桔梗[5]、黃花菜[6]、肉豆蔻[7]等具有緩解抑郁癥的功能。

人類腸道中微生物數量繁多、群落復雜且種屬豐富，影響著人們的健康[8]。有研究表明，許多疾病的產生都與腸道菌群失衡有關，其與抑郁癥之間通過“腦-腸-微生物”軸相互影響[9-11]。據研究證實，大腦海馬區域中腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在腸道菌群變化后也會發生一定程度上的改變[12]。BDNF可促進腦細胞與神經的生長，當BDNF的表達下調時引起神經再生下降，從而導致抑郁相關癥狀；當BDNF表達水平提高時，海馬神經元的損傷得到恢復，可改善認知和情緒[13]。研究表明乳酸菌與雙歧桿菌可通過改變腸道組成和腸道菌群多樣性、降低炎癥因子、調節中樞神經系統等機制緩解抑郁癥[14]。

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa，簡稱黑果）是一種食用漿果，多酚含量在現有報道植物中居于首位，多酚主要為原花青素、酚酸等，具有抗氧化、免疫調節、抗炎等多種功效[15,16]。據報道多酚可通過抑制腦組織氧化應激反應改善慢性不可預知應激引起的小鼠抑郁[17,18]。此外，多酚腸道菌群代謝物還具有促進心理狀況的功效[19]。黑果在食品加工行業中的應用主要集中與制作果汁[20]和釀造果酒[21]等，此外有研究表明黑果多酚還具有改善糖尿病[22]、改善高血壓[23]、抗癌[24]等功能，但對其在抑郁癥腸道菌群與腦神經等影響效果和機制未有報道。因此，本文以黑果多酚提取物為原料，探究其對抑郁癥小鼠腸道菌群與BDNF影響作用，揭示其對抑郁癥小鼠調節機理，探索黑果作為功能性食品的高值化開發價值和發展前景，以期為拓寬黑果的應用領域，提升其經濟價值，更好地為人們的健康提供資源和思路，進而創造更大的社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑果多酚提取物與試劑

黑果取自淄博市鐵山林場。皮質酮由江蘇佳爾科藥業集團有限公司提供；氟西汀由山東西亞化學工業有限公司提供；碳酸鈉購自阿拉丁化學試劑公司；沒食子酸標準品、福林酚試劑等其它常用試劑購自上海愛純生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物

BALB/C雄性健康小鼠，生產許可證號SCK(魯) 2014-0007，質量18～22 g，7～8周齡，配套標準飼料與墊料由濟南金豐實驗動物有限公司提供。

1.1.3 主要儀器設備

FD-1A-50冷凍干燥機，杭州聚同電子有限公司；酶標儀，飛世爾（上海）儀器有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳儀，BIO-RAD公司。

1.2 主要實驗方法

1.2.1 黑果多酚提取

以黑果果實（葉）為原料，提取制備多酚，將新鮮黑果果實（葉）洗凈，打漿。稱取5 g漿液按照1:5料液比添加適量50%乙醇超聲40 min，抽濾，濾液在50 ℃條件下減壓除去乙醇，經凍干后冷凍保存，備用。

1.2.2 黑果多酚含量的測定

采用福林酚法[25]測定多酚的含量，并稍做修改，標準液為沒食子酸，在765 nm處測定其吸光度。

配制1 mg/mL凍干黑果多酚提取物，其他操作同上。

標準曲線y=0.397x-0.0001，r=0.99測得黑果果實和黑果葉子多酚含量分別為19.59、18.60 mg/g。

1.2.3 抑郁癥小鼠模型的建立

90只健康雄性的BALB/C小鼠隨機平均分為9組。對照組（D）為健康小鼠以灌胃方式給與0.20 mL的生理鹽水；模型組（M）通過注射0.20 mL、4 mg/mL皮質酮建立抑郁癥小鼠模型；藥物組（陽性對照組Y）皮下注射0.20 mL、4 mg/mL皮質酮和0.20 mL氟西??；黑果果實多酚提取物低、中、高劑量組分別皮下注射0.20 mL、4 mg/mL皮質酮與以灌胃方式給與40、60、80 mg/kg黑果果實多酚提取物（HGd、HGz、HGg）；黑果葉子低、中、高劑量組分別皮下注射0.20 mL、4 mg/mL皮質酮與以灌胃方式給與15、22.50、30 mg/kg黑果葉子多酚提取物（HYd、HYz、HYg）。所有小鼠每天給與一次藥物注射與黑果多酚灌胃，4周后進行動物行為實驗。

1.2.4 行為學實驗

1.2.4.1 強迫游泳實驗

小鼠于水深12 cm（水溫約為22～25 ℃）容器中。實驗時長為6 min，記錄3～6 min小鼠累計不動的時間[26]。

1.2.4.2 糖水偏好實驗

實驗開始前48 h對小鼠先進行一次糖水偏好訓練。每個鼠籠中都預先放置純凈水和1%的蔗糖水，每次間隔0.50 d互換水瓶的位置。訓練完畢，小鼠禁止進食24 h后，自由飲用6 h，統計每只小鼠的純水和蔗糖水飲用重量。糖水偏愛率=糖水消耗重量/(糖水消耗重量+純水消耗重量)×100%[27]。

1.2.4.3 懸尾實驗

將小鼠尾巴末梢固定于桿上，使小鼠處于頭部朝下倒掛，使頭部與地面相差約50 cm，周圍用白色塑料板隔離。實驗時長6 min，記錄3～6 min小鼠累計的不動時間[28]。

1.2.5 大鼠腸道菌群測定

實驗結束，將小鼠糞便存入滅菌EP管中，并置于液氮中凍存。腸道菌群多樣性、菌群群落、主成分等委托上海美吉生物醫藥科技有限公司測定。

1.2.6 BDNF測定

小鼠脫頸致死，無菌環境下取大腦皮層底部海馬組織，采用王賽等[29]的實驗方法并稍做修改測定小鼠大腦BDNF水平。

試驗結束后按照學校實驗衛生要求，將廢棄物集中暫存在實驗室中，由學校統一集中處理。

1.3 數據分析

每組做3個平行。利用SPSS 19數據分析，Origin 8.5作圖。

2 結果與討論

2.1 行為學實驗結果分析

小鼠不同行為學實驗模擬人類在抑郁癥中的絕望狀態，反映了小鼠抑郁的程度及模型建立是否成功[30]。由圖1數據表明，在FST與TST中模型組小鼠的不動時間（與正常組相比）均顯著延長；對糖水的偏好率顯著降低，模型組小鼠焦慮性行為顯著增加，表明抑郁癥模型建模成功。與模型組相比，各黑果多酚劑量組均能顯著降低小鼠在FST與TST中的不動時間并顯著提高糖水偏好率，表明黑果多酚可改善抑郁癥小鼠的焦慮性行為。行為不同，抑郁程度與黑果多酚提取物劑量關系不同，整體呈現劑量依賴性關系。結合劑量、效果和成本等因素綜合考慮，黑果果實提取物最佳劑量為中劑量組（60 mg/kg）。此外，黑果多酚提取物與模型組、正常組之間均有顯著差異，說明本實驗中黑果多酚提取物起到了顯著調節抑郁行為效果，但還沒有完全調整恢復到正常狀態。三種行為實驗中黑果多酚提取物最佳劑量不同，這是因為各行為實驗涉及小鼠生理、心理等指標、作用途徑、機制等不同。綜上，黑果多酚提取物可以顯著改善抑郁行為，這與文獻所報道綠茶多酚可以增強抑郁小鼠的自主活動性的實驗結果類似[31]。

2.2 腸道菌群稀釋曲線分析

稀釋曲線的數據序列是隨機從實驗樣本中抽取的，本次測序數據量是否足夠可根據曲線是否達到平緩來判斷[32]。圖2所示，在所測序列較少時，OTUs的數量顯著增加；隨著所測序列增加，表明樣品中的大多數微生物類群在測序量中得以體現。圖3 Shannon指數呈現平緩趨勢，表明取樣合理。從圖2、圖3可以看出，模型組Shannon值與Sobs值顯著高于空白組，表明抑郁癥促使小鼠腸道菌群的多樣性水平上升。與模型組相比，藥物組、HG低、高劑量組與HY中劑量組的Shannon值均顯著降低，這表明藥物與合適劑量的黑果多酚提取物對降低小鼠腸道菌群多樣性具有積極影響。綜上，藥物與黑果多酚提取物具有調節抑郁癥小鼠腸道菌群多樣性的作用，但與正常組Sobs值與Shannon值仍存在顯著差異，表明藥物與黑果多酚提取物并未將抑郁癥小鼠腸道菌群多樣性完全恢復至正常水平，此外小鼠腸道菌群多樣性與黑果果實提取物劑量關系呈現劑量負相關。

2.3 Alpha多樣性分析

描述Alpha多樣性的指標通常有Chao、Ace、Shannon、Simpson等指數，Chao、Ace指數反映樣品中群落的豐富度；Shannon、Simpson指數反映群落的多樣性[33]。表1結果顯示，模型組的Ace值（與正常組相比）明顯降低，表明小鼠在抑郁狀態下的腸道菌群的豐富度低于正常情況時；而藥物組Ace值與Chao值均顯著低于模型組，表明藥物不具有顯著提高抑郁小鼠腸道菌群豐富度的作用。HG低、中劑量組與HY低劑量組與模型組相比豐富度顯著提高，表明適當劑量的黑果多酚具有提高抑郁癥小鼠腸道菌群豐富度的積極作用；藥物組和HG組與空白組豐富度和多樣性仍存在顯著差異，表明藥物和黑果多酚提取物未能將抑郁癥小鼠腸道菌群豐富度和多樣性調節至正常水平。黑果果實多酚提取物與菌群豐富度呈劑量負相關，且HG高劑量組的小鼠腸道菌群豐富度和多樣性與空白組接近。

表1 黑果多酚提取物對小鼠腸道菌群ALPHA多樣性分析的影響 Table 1 Effects of polyphenol extracts from Aronia melanocarpa on ALPHA diversity analysis of intestinal flora in mice

由上文與表1結果表明，模型組小鼠的腸道菌群多樣性相較于正常組略有提升，實驗結果與蔣海寅[34]實驗結果基本相同，其提高的原因可能為小鼠體內有害菌種類增加。上述結果表明適當劑量的黑果多酚提取物具有改善抑郁癥小鼠腸道菌群失調的功能，與Guo等[35]實驗結果相同，多酚對調節腸道菌群平衡，改善健康具有積極作用。

2.4 群落組成測定分析

在門水平，空白組腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）組成，總比例達88.83%，其次為放線菌門（Actinobacterias）。相關研究表明，抑郁癥患者腸道菌群與健康人群差異較大[36]。從圖5看出，與空白組相比，模型組小鼠腸道菌群擬桿菌門豐度顯著提高，厚壁菌門豐度降低，表明抑郁癥會改變腸道菌群比例，從而導致菌群失調，與蔣海寅[34]相關臨床研究抑郁癥患者的菌群結構變化結果基本一致。

擬桿菌是一種寄居在人體的腸道中的致病菌，當機體內腸道菌群失調時，可導致感染與炎癥等疾病的發生；擬桿菌門中的致病菌prevotella，該菌屬細菌表面具有促進人體分泌IL-8mRNA的脂多糖，會加重炎癥[37]。從圖5看出，藥物組、HG組與HY組擬桿菌門的比例均低于模型組，表明黑果多酚提取物與藥物具有抑制擬桿菌門的作用；HG高劑量組擬桿菌門比例與空白組差異不顯著，表明高劑量的黑果可將抑郁癥小鼠擬桿菌比例恢復至正常水平。厚壁菌門中的毛螺菌科參與短鏈脂肪酸（SCFAs）的代謝生產，SCFAs 可支持腸道上皮組織細胞活動，降低致病菌經由腸粘膜屏障入侵的概率，還可以促進5-HT分泌[38]。HG與HY中厚壁菌門比例均高于模型組，表明黑果中的多酚提取物有益于厚壁菌門的增殖；黑果劑量組厚壁菌門比例與空白組存在顯著差異，表明黑果提取物未能將抑郁癥小鼠腸道內厚壁菌門比例調節至正常水平；黑果提取物各劑量組厚壁菌門比例差異較小，表明黑果提取物劑量對厚壁菌門豐度無顯著影響。從圖4可知，與HY組不同，HG組小鼠腸道菌群中均出現疣微菌門。該屬中的Akkermansia muciniphila能夠產生SCFAs，可為人體提供日?；顒铀枘芰?，促進腸道內部健康[39]。綜上可得，黑果多酚提取物對腸道菌群組成與豐度具有顯著影響，黑果不同部分提取出的多酚對小鼠腸道菌群會產生不同影響，但整體上未能將抑郁小鼠腸道菌群調節至正常平衡狀態。

2.5 PCA分析

應用主要成分分析（Principal Component Analysis，PCA）所研究的對象是小鼠腸道菌群組成的整體差異，樣本物種組成重合度越高，在PCA圖中距離越近[40]。圖6a表明空白組主要在PC2方向上與其他組產生差異，PC2解釋24.93%的差異性，空白組與藥物組、HGg組的小鼠腸道菌群組成相似性極高。圖6b表明空白組與其他組的差異主要在PC2方向上，PC2可以解釋23.83%的差異性，表明空白組與藥物組、HYg組的小鼠腸道菌群組成相似性極高。綜上，小鼠在抑郁與焦慮狀態下腸道菌群失衡，藥物與黑果多酚提取物可顯著改善抑郁癥小鼠腸道菌群紊亂狀況，并且高劑量的黑果果實多酚提取物、高劑量的黑果葉子多酚提取物調節抑郁癥小鼠腸道菌群的功效最佳。

2.6 BDNF分析

海馬、前額葉和杏仁核發揮著調節情緒與心理應激反應等作用，部分人群在患有抑郁癥后，海馬和前額葉活動功能受損，杏仁核功能卻得到增強，甚至會造成海馬萎縮[41]。

從圖7、圖8可以看出，模型組BDNF表達水平相較于空白組明顯降低，抑郁癥使小鼠的腸道菌群失衡，菌群的改變誘發了精神紊亂，從而抑制了小鼠海馬中BDNF的表達，使其低于正常水平。從圖7可以看出，與模型組相比，藥物與黑果果實多酚干預后，小鼠BDNF水平顯著提高，表明藥物與黑果果實多酚提取物有利于BDNF的釋放，其中HG中劑量組效果最佳，BDNF水平可顯著提高81.39%；HG劑量組BDNF水平顯著高于空白組，表明黑果果實多酚提取物還未能將BDNF水平調節至正常水平。從圖8看出，與模型組相比，HY組BDNF表達水平均未得到顯著上調，表明黑果葉子多酚提取物對于BDNF的釋放不具有積極影響。綜上可得，黑果果實多酚提取物對大腦海馬中BDNF的表達具有顯著提高作用，周蓉等也發現多酚可提高抑郁大鼠海馬體中BDNF的表達水平[42,43]。黑果果實組小鼠大腦中BDNF水平的提高，可能的原因一方面是由于黑果果實多酚提取物發揮一定的抗氧化作用從而減少了氧化應激對腦神經造成的損害；另一方面則是因為黑果果實多酚提取物將抑郁小鼠的腸道菌群豐富度與多樣性恢復到正常水平，因此小鼠大腦中BDNF水平提高了[44]。

3 結論

3.1 通過本研究發現抑郁癥使得正常小鼠的腸道菌群發生顯著變化：腸道菌群多樣性顯著降低，擬桿菌門比例顯著提高31.03%，厚壁菌門比例降低45.16%；大腦中BDNF水平顯著降低35.23%。黑果果實、葉子多酚提取物干預抑郁癥小鼠后，腸道菌群多樣性可顯著提高18.23%；黑果果實多酚提取物干預抑郁癥小鼠后，小鼠腦內BDNF表達顯著增強81.39%。

3.2 綜上所述，本研究探索了黑果葉子、果實的多酚提取物調節抑郁癥小鼠模型的作用關系和菌群機制。結果表明黑果多酚對抑郁癥具有一定的調節效果，黑果可作為功能性食品干預調節抑郁癥。本文為進一步合理利用黑果、提高黑果的科技含量、開發功能性食品提供一定的理論基礎。